Caffeine을 HEK-293 세포에 처리했을 때 hERG current의 변화에 따른 억제율 측정

Alternative Author(s)
Yang Bo Yeon
공학대학원 화학생명공학과
The Graduate School, Ajou University
Publication Year
caffeinehERG current
본 연구는 식물성 알칼로이드 계에 속하는 caffeine을 hERG 칼륨 이온 채널을 안정하게 발현시킨 HEK-293 세포에 처리하여 hERG 채널에 미치는 영향을 확인하였으며, Ikr/hERG 전류의 감소는 LQTS의 marker로 간주된다. 이는 약물에 의한 LQTS는 심장 질환의 하나인 부정맥의 원인이 될 수 있기에 심장독성을 평가하는데 목적이 있다. Caffeine을 과다 섭취하거나 급성으로 투여하게 되면 중추신경계에 영향을 미치며 심장 질환을 유발할 수 있다는 결과가 보고되었다. 따라서 이 실험에서는 실험물질을 caffeine으로 설정하였고 hERG 칼륨 채널 전류를 측정하는 patch clamp를 사용하였다. Patch clamp에 일정량의 HEK-293 세포 현탁액을 분주한 후 일정시간 부착시켰고, NT solution을 관류시켰다. Chamber에 부착된 단세포를 선택한 후 whole cell을 만들어 음성대조물질, 농도에 따른 caffeine 또는 양성대조물질을 관류하여 각 물질에 따른 hERG current를 측정하였다. 측정된 current를 통해 각 물질에 따른 억제율을 구할 수 있었다. 음성대조물질군, caffeine 농도 4개 군 및 양성대조물질군으로 총 6개의 군으로 설정하였으며, 양성대조물질군을 제외한 5개의 군에는 각 3개의 세포에서 측정하였고, 양성대조물질군은 5개의 세포에서의 hERG current를 측정하였다. 그 결과 억제율은 음성대조물질군 4.7±3.2%, Caffeine 처리 군에서는 각각 31.3±4.4%, 34.0±5.7, 48.9±4.9%, 63.5±0.5% 였으며, 양성대조물질군에서는 91.3±0.7%를 나타내었다. Caffeine처리군과 양성대조물질군의 억제율은 음성대조물질군의 억제율 결과값을 이용하여 보정된 억제율이다. 이렇게 얻어진 억제율을 이용하여 검정곡선을 통해 6.16mM의 IC50값을 산출하였다.사용된 세포주가 칼륨 채널에 대한 선택적 억제제로서 적합하게 작용되었는지 확인하기 위해 사용된 양성대조물질인 E-4031을 처리하였으며, hERG 채널에 대한 peak current의 억제율 평균이 90% 이상으로 실험에 적합한 것으로 확인되었다. Caffeine 처리군의 모든 농도에서 억제율은 통계학적으로 유의하게 증가하였다. 약물에 의한 심실성 재분극 지연을 평가하기 위한 in vitro 다중 심장 이온채널 또는 hiPSC-CMs 활동전위 평가시험법에 대한 연구가 진행되고 있다. 다양한 시험법의 개발을 통해 약물의 부작용을 평가하는 데 사용되는 실험동물의 사용을 줄이고 단일화된 시험법으로 인한 위음성의 가능성을 줄여 약물로 인한 심장독성의 영향을 평가하는 근거가 될 수 있다.
Alternative Abstract
This study confirmed the effects of caffeine belonging to the plant alkaloid system on the hERG channel by treating the hERG potassium ion channel stably expressed in HEK-293 cells, and the reduction of Ikr/hERG current is considered a marker of LQTS. This is aimed at evaluating heart toxicity because drug-induced LQTS can cause arrhythmia, one of the heart diseases. It has been reported that excessive intake of caffeine or acute administration can affect to central nervous system and cause heart disease. Therefore, in this experiment, the material was set to caffeine and a patch clamp was used to measure the hERG potassium channel current. A certain amount of HEK-293 cell suspension was dispensed to the patch clamp chamber, attached for few minutes, and NT solution was perfused. After selecting a single cell attached to the chamber, a whole cell was made to purfuse negative control materials, caffeine according to concentration, or positive control materials to measure the hERG current according to each substance. Through the measured current, the inhibition rate could be obtained. A total of 6 groups were set as negative control material group, caffeine concentration group, and positive control material group. 3 cells were measured in each 5 groups excluding positive control material group, and 5 cells were measured in positive control material group. As a result, the inhibition rate was 4.7±3.2% in the negative control group, 31.3±4.4%, 34.0±5.7, 48.9±4.9%, and 63.5±0.5% in the caffeine treatment group, and 91.3±0.7% in the positive control group. The inhibition rate of the caffeine treatment group and the positive control group is a compensated inhibition rate corrected using the result value of the inhibition rate of the negative control group. Using the inhibition rate obtained in this way, an IC50 value of 6.16 mM was calculated through a calibration curve. E-4031, a positive control substance used to confirm whether the cell lines used acted appropriately as selective inhibitors for the potassium channel, was treated, and the average inhibition rate of peak current for the hERG channel was found to be suitable for the experiment at 90% or more. At all concentrations of the caffeine treatment group, the inhibition rate increased statistically significantly. Research is being conducted on the invitro multi-cardiac ion channel or hiPSC-CMs activity potential evaluation test method to evaluate the delay in ventricular repolarization by drugs. Through the development of various test methods, the use of experimental animals used to assess drug side effects and the possibility of false negatives due to a single test method can be reduced, thus providing a basis for assessing the effects of drug-induced heart toxicity.

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