Caffeine을 HEK-293 세포에 처리했을 때 hERG current의 변화에 따른 억제율 측정

Abstract

본 연구는 식물성 알칼로이드 계에 속하는 caffeine을 hERG 칼륨 이온 채널을 안정하게 발현시킨 HEK-293 세포에 처리하여 hERG 채널에 미치는 영향을 확인하였으며, Ikr/hERG 전류의 감소는 LQTS의 marker로 간주된다. 이는 약물에 의한 LQTS는 심장 질환의 하나인 부정맥의 원인이 될 수 있기에 심장독성을 평가하는데 목적이 있다. Caffeine을 과다 섭취하거나 급성으로 투여하게 되면 중추신경계에 영향을 미치며 심장 질환을 유발할 수 있다는 결과가 보고되었다. 따라서 이 실험에서는 실험물질을 caffeine으로 설정하였고 hERG 칼륨 채널 전류를 측정하는 patch clamp를 사용하였다. Patch clamp에 일정량의 HEK-293 세포 현탁액을 분주한 후 일정시간 부착시켰고, NT solution을 관류시켰다. Chamber에 부착된 단세포를 선택한 후 whole cell을 만들어 음성대조물질, 농도에 따른 caffeine 또는 양성대조물질을 관류하여 각 물질에 따른 hERG current를 측정하였다. 측정된 current를 통해 각 물질에 따른 억제율을 구할 수 있었다. 음성대조물질군, caffeine 농도 4개 군 및 양성대조물질군으로 총 6개의 군으로 설정하였으며, 양성대조물질군을 제외한 5개의 군에는 각 3개의 세포에서 측정하였고, 양성대조물질군은 5개의 세포에서의 hERG current를 측정하였다. 그 결과 억제율은 음성대조물질군 4.7±3.2%, Caffeine 처리 군에서는 각각 31.3±4.4%, 34.0±5.7, 48.9±4.9%, 63.5±0.5% 였으며, 양성대조물질군에서는 91.3±0.7%를 나타내었다. Caffeine처리군과 양성대조물질군의 억제율은 음성대조물질군의 억제율 결과값을 이용하여 보정된 억제율이다. 이렇게 얻어진 억제율을 이용하여 검정곡선을 통해 6.16mM의 IC50값을 산출하였다.사용된 세포주가 칼륨 채널에 대한 선택적 억제제로서 적합하게 작용되었는지 확인하기 위해 사용된 양성대조물질인 E-4031을 처리하였으며, hERG 채널에 대한 peak current의 억제율 평균이 90% 이상으로 실험에 적합한 것으로 확인되었다. Caffeine 처리군의 모든 농도에서 억제율은 통계학적으로 유의하게 증가하였다. 약물에 의한 심실성 재분극 지연을 평가하기 위한 in vitro 다중 심장 이온채널 또는 hiPSC-CMs 활동전위 평가시험법에 대한 연구가 진행되고 있다. 다양한 시험법의 개발을 통해 약물의 부작용을 평가하는 데 사용되는 실험동물의 사용을 줄이고 단일화된 시험법으로 인한 위음성의 가능성을 줄여 약물로 인한 심장독성의 영향을 평가하는 근거가 될 수 있다.