Death receptor5에 대한 유사면역 인간항체 라이브러리의 구축 및 분리된 인간항체의 동정

Abstract

TNF-related apoptosis inducing ligand (TRAIL 또는 APO2L)에 의한 Death receptor (DR)-4 및 5의 경로를 통해 활성화되는 세포자멸사 (apoptosis, programmed cell death) 기작은 정상세포에는 부작용이 적고 암세포에 특이적이므로 매우 중요한 암 치료제 개발의 표적 물질로 여겨져 왔다. 본 연구에서는 정상인 60명으로부터 혈액을 채취하여 4가지의 TRAIL 수용체 (DR5, DR4, DcR1, DcR2)에 대한 항체 역가 (titer)를 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)를 통해 분석한 후 DR5 항원에 대해 높은 항체역가를 보이는 혈액 (8명)의 lymphocyte로부터 mRNA를 추출하고 효모표면발현계 (yeast surface display system)을 이용하여 인간 scFv 항체 라이브러리 (size ~ 2×106)를 구축하여 이를 유사면역 라이브러리 (pseudo-immune library)라 명명하였다. 목표 항원인 DR5를 biotinylation한 후Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS, BD FACScallibur)를 이용하여 유사면역 라이브러리로부터 DR5 특이항체를 선별하였다. 선별된 항체는 (HW1~HW6) 비면역라이브러리 (non-immune 또는 naïve library, size ~ 1×109)로부터 같은 항원에 대해 선별된 항체에 비해 (SH1~SH5) 높은 친화도를 보였다. 따라서 유사면역 라이브러리의 구축은 비면역 라이브러리보다 크기가 크지 않더라도 특정 항원에 대해 높은 친화도를 갖는 항체를 선별하는 데 있어 매우 효과적인 전략이라 할 수 있다. 선별된 항체를T7 promoter-pelB periplasmic targeting sequence-scFv-FLAG tag-6His tag으로 디자인된 expression vector pKJ1에 subcloning하여 E. coli BL21(DE3)에서 발현시킨 후 TALON cobalt resin을 이용하여 정제하였다. MTT assay를 이용해 정제된 항체의 다양한 암세포에 대한 cytotoxicity를 평가하였으며 apoptosis에 의한 세포사멸 유무는 FACS analysis (annexin, propidium iodide staining)를 통해 평가하였다. 그 결과 scFv HW1, HW6, SH3가 암세포에 특이적으로 apoptosis를 유발하는 것으로 관찰되었다. 특히 HW1과 HW6는 TRAIL sensitive cancer cell line인 HL60 (human acute myeloid leukemia cell line)와 HCT116 (human colon cancer cell line) 그리고 TRAIL resistant cancer cell line인 HepG2 (human hepatocellular carcinoma cancer cell line) 모두에 apoptosis에 의한 세포사멸을 유도한 반면, SH3는 TRAIL sensitive cancer cell line에서만cytotoxicity를 보였다.