메타게놈으로부터 새로운 esterase의 cloning

Abstract

일반적으로 chiral성을 갖고 있는 의약품들의 대부분은 한 가지 enantiomer만이 약리활성을 갖는 것으로 알려지면서 최근 single enantiomer 의약품의 생산에 관심이 집중되고 있다. 본 연구에서는 비스테로이드계 소염진통제인 racemic ketoprofen을 효소적인 방법으로 (R)-과 (S)-ketoprofen을 분할하기 위하여 극히 제한된 수의 대략 1% 정도의 배양 가능한 미생물에서만 실험을 수행하는 것이 아니라, 난 배양성 및 미 배양 미생물등 여러 가지 다양한 원핵 미생물의 유전체가 혼합된 메타게놈으로부터의 균주탐색과 유전자 클로닝을 수행하였다. Esterase activity staining의 top agar overlay를 통해 1차 선별된 거대한 크기를 가진 fosmid clone을 여러 가지 제한효소 절단하였다. 제한효소의 선정 기준은 토양에 90% 이상을 차지하는 이미 잘 알려진 Pseudomonas 와 Bacillus esterase 유전자를 절단하는 제한효소 site가 많으면서, 그 외 다른 type의 종들이 가지는 esterase 유전자를 절단하는 제한효소 site가 적은 순서대로 clustal W program에서 multiple sequence alignment를 하여 Web cutter program에서 제한효소 site를 alignment 하였다. 선정된 여러 가지 제한효소를 처리하면서 esterase activity가 있는 2.5 kb의 DNA fragment를 얻을 수 있었고, pBluescript SK Ⅱ(+) vector에 subcloning을 하였다. Sequencing을 통해 얻어진 염기서열을 바탕으로 ORF search를 하여 esterase의 conserved domain을 포함하고 있는 870 bp의 nucleotide sequence의 ORF를 찾을 수 있었다. 290 개의 amino acid 서열의 상동성 분석결과 대부분의 esterase들과 50% 이하의 유사도를 보여주며, 새로운 형태의 esterase임을 확인 할 수 있었다. Blast search를 통한 검색 결과, Bacillus subtilis 유래의 brefeldin A esterase와 52%, Burkholderia cepacia R18194 유래의 esterase/lipase 와 34%, Archaeoglobus fulgidus DSM 4304 유래의 carboxylesterase (estA), Bradyrhizobium japonicum USDA 110 유래의 probable esterase, Novosphingobium aromaticivorans DSM 12444 유래의 esterase/lipase와 33%, Sulfolobus solfataricus P2 유래의 lipase, Propionibacterium acnes KPA 171202 유래의 lipase/esterase와 32%, Symbiobacterium thermophilum IAM 14863 유래의 putative lipase와 30%의 유사성을 나타내었다. 또한 이들 esterase 모두 일반적으로 알려진 esterase의 active site인 Gly-X-Ser-X-Gly sequence가 존재함을 알 수 있었다. 그리고 재조합 단백질 정제를 위해 870 bp인 KYJ25를 pQE30 vector에 subcloning 하였다. SDS-PAGE에서 KYJ25 단백질 크기가 30 kDa이라는 것이 확인 되었고, ρNP ester 중에서 ρ-nitrophenyl acetate 에 대한 활성이 가장 높았으며, ρ-nitrophenylbutyrate보다 탄소 사슬이 4개 더 증가한 ρ-nitrophenylcaprylate는 그 활성이 약 10% 정도 급격히 떨어졌다. ρ-nitrophenyl acetate를 기질로 하여 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)에서 기질 농도를 변화시키면서 효소의 활성을 측정한 후 Lineweaver-Burk plot을 작성한 결과, K_(m)과 V_(max)가 각각 1.58mM과 84. 75 umoles/mg-protein/min으로 나타났다.