Archaeoglobus fulgidus로부터 내열성 esterase의 클로닝과 특성연구

Abstract

효소의 산업적 응용 가능성이 높아지면서 각각의 목적에 맞는 새로운 효소들에 대한 필요성이 증가하고 있다. 특히 높은 열이나 유기용매가 요구되는 공정에는 일반적인 생태계에서 분리한 효소를 사용하기에는 무리가 따른다. 극한 미생물 특히 90℃ 이상의 환경에서 자랄 수 있는 초 고온성 미생물들로부터 유래한 효소들은 매우 높은 열안정성가지고 있어, 그 이용 가능성이 매우 높다. 또한, 이 열안정성 효소들은 그 구조적 특징들로 인하여 단백질 변성제에 대한 내성이 크다고 알려져 있다. 이러한 열안정성과 단백질 변성제에 대한 내성은 효소의 산업화에 있어서 아주 중요한 조건중의 하나이다. 정밀화학 공정으로 생산되는 의약품과 구충제를 포함한 대부분의 화학제품들은 ester 화합물이고, 이들은 estease에 의해 가수분해가 이루어진다. Esterase는 높은 광학특이성과 더 불어 넓은 기질 수용성을 가지고 있어 화학 약품 합성이나 식품 생산 공정, 광학 분할 연구 등에 폭 넓게 이용되고 있다. 열안정성 esterase를 cloning 하기위하여 이미 전체 유전자 염기서열이 밝혀져 있는 극한 미생물을 대상으로 검색을 실시하여 Archaeoglobus fulgidus DSM 4304로부터 esterae로 추정되는 유전자를 찾아 cloning 하였다. 이 미생물의 전체 유전자의 염기 서열을 바탕으로 putative esterase의 증폭을 위하여 specific primer를 제작하고 PCR을 통해 E. coli XL1-Blue를 숙주로 하여 pQE30 vector에 cloning 하였다. 형질 전환체는 α-naphthyl acetate와 Fast Blue RR salt 또는 Fast Blue B salt를 이용한 activity staining을 통하여 쉽게 선별할 수 있었으며, 이 방법에 75℃에서 열처리하는 과정을 추가하여 열안정성을 확인하였고, LB agar 배지에 ketoprofen ethyl ester를 첨가하여 재조합 esterase의 ketoprofen ethyl ester에 대한 활성의 유무를 확인 할 수 있었다. Cloning 된 esterase는 총 247개의 아미노산으로 이루어 진 약 27.5 kDa의 분자량을 가진 monomer이었다. 단백질 서열 분석 결과 일반적으로 알려진 esterase의 active site인 G-X-S-X-G(GHSLG)의 반복서열을 나타내고 있다. ρ-Nitrophenol에 결합된 acyl chain의 길이에 따른 반응성에 대한 조사 결과 ρ-nitrophenylbutyrate(pNPC4)에 대하여 가장 높은 반응성을 보였고, 80℃에서 가장 높은 specific activity를 보였다. 탄소 사슬이 8개 이상인 ρ-nitrophenyl ester에 대한 활성은 급격히 감소하였다. Ketopfrofen ethyl ester를 기질로 사용한 경우에는 70℃ 에서 가장 높은 활성을 보였으며, 90℃에서 3시간 방치한 뒤로 약 10% 정도의 활성이 남아 있었다. pH 7과 pH 8에서 거의 비슷한 정도로 높은 활성을 보였다. Ketoprofen ethyl ester에 대한 Km 값은 1.6 mM 이었으며, Vmax는 1.7 μmole/mg protein/min이었다. Cloning 된 esterase는 기존에 보고된 중온성 esterase 보다 열안정성 면에서는 우수하지만, (R,S)-Ketopfrofen ethyl ester에 대한 enantioselectivity는 현저히 떨어진다. 따라서, error prone PCR, site directed mutagenesis와 DNA shuffling등의 in vitro protein evolution 기술을 통하여 열안정성과 함께 (R,S)-Ketopfrofen ethyl ester에 대한 높은 enantioselectivity를 가지는 mutant esterase를 찾는 연구가 계속 진행 되어야 할 것이다.