Streptomyces avermitilis의 에스-아데노실메티오닌 합성효소 특성과 폴리케티드 항생제 생성에 미치는 영향

Abstract

Streptomyces avermitilis NRRL8165로 부터 모든 생명체의 methyl group donor인 S-adenosylmethionine (SAM)을 생합성하는 S-adenosylmethionine synthetase (SAM-s)의 gene을 클로닝하여, 유전자에 대한 분석과 발현 단백질의 효소적 특성에 대하여 조사하였다. 분리된 전체 SAM-s gene은 1,454 bp 이었으며, 이 유전자의 245 bp에 start codon인 GTG을 시작으로 1,209 bp의 open reading frame (ORF)을 가진 것으로 확인 되었다. SAM-s gene의 유전자 서열을 분석한 결과 68.7%의 높은 G+C의 비율을 나타내었으며, start codon의 upstream으로 -3 bp에 purine-rich ribosomal binding site (RBS)와 –35, –10 consensus promoter sequences가 있는 것을 확인하였다. S. avermitilis NRRL5776의 ORF SAM-s 유전자는 402 개의 아미노산을 암호화하고 있으며, 이미 밝혀진 다른 Streptomyces 종의 SAM-s 아미노산 서열과 비교 분석한 결과 매우 높은 아미노산 서열의 상동성 (84-93%)을 보였으며, ATP binding site로 알려진 P-loop의 nonapeptide 276GGGAFSGKD 284 와 metal binding site (Mg2+: 17D 와 289D 그리고 K+: 49G)와 일치된 서열을 갖고 있음을 확인하였다. 또한, S. avermitilis NRRL8165에서 분리한 ORF SAM-s gene을 Escherichia coli에서 형질 전환시켜 발현시킨 S-adenosylmethionine (SAM) synthetase의 분자량은 약 43.5 kDa 이었다. 분리된 효소를 in vitro에서 ATP와 L-methionine을 기질로 효소반응을 유도시켜 반응산물인 SAM을 HPLC, TLC로 확인하였다. SAM-s의 enzyme kinetic parameter에서 ATP에 대해서는 340(±18) μM의 Km과 21.6(±1.5) μmol/mg/min의 Vmax, 0.22 s-1의 Kcat 값을 나타내었으며, L-methionine에 대해서는 110(±32) μM의 Km과 7.9(±0.2) μmol/mg/min의 Vmax, 0.14 s-1의 Kcat 값을 나타내었다. 따라서 분리된 SAM-s 유전자가 SAM-s 단백질을 암호화하고 있음을 증명하며, 또한 Streptomyces 에서 처음으로 SAM-s 단백질의 enzymatic kinetics 특성을 밝혀내었다. SAM-s 단백질에 대한 효소적 활성은 pH 8.0과 35oC에서 최대의 활성을 보였으며, 다른 동(미)생물과 마찬가지로 Mg2+ 또는 Mn2+와 같은 이가 양이온을 cofactor로써 필요함을 밝혀내었다. Avermectin 및 oligomycin을 생산하는 S. avermitilis와 doxorubicin을 생산하는 S. peucetius 배양액에 SAM을 첨가하여 항생제 생성에 대한 영향을 알아본 결과 avermectin B1a의 경우, 1000 μM SAM 농도에서 SAM을 첨가하지 않은 것보다 약 4.1배 정도 생성이 증가하였으며, Oligomycin A, C에 있어서 100 μM SAM 농도에서 SAM을 첨가하지 않은 것보다 각각 약 3.2배, 2,1배 생성이 증가하였다. Doxorubicin의 경우, 500 μM SAM 농도에서 SAM을 첨가하지 않은 것 보다 약 4배 정도의 생성이 증가하였다. S. avermitilis와 S. peucetius에 SAM-s을 과대발현 시킨 결과 dry cell weight 기준으로 twild type과 비교해서 avermectin는 약 2.2배, oligomycin A, C는 각각 1.9배, 1.7배로 생성이 높아 졌으며, sporulation도 억제를 하였다. 또한 doxorubicin는 약 3.5배의 생산성 향상을 보였다. 그러므로 SAM은 세포의 형태학적 변화에 대해서 뿐만 아니라 methyl가 요구되어지는 polyketide계 항생물질에 대해서 생산성을 증가시킬 수 있는 다형질의 물질임을 보여 주였다