저강도 초음파 자극이 중간엽 줄기세포의 연골분화 과정 동안 신생혈관형성에 미치는 영향

Abstract

목적 : 본 연구에서는 중간엽 줄기세포를 연골로 분화시키는 과정 동안 신생혈관 형성에 대한 저강도 초음파의 효과에 대해 조사하였다. 저강도 초음파 자극을 전처리할 경우 중간엽 줄기세포의 연골조직으로의 분화를 촉진시키고 골 형성과정을 지연시킨다는 선행 연구결과를 바탕으로 본 연구에서는 그 기전을 관찰하고자 신생혈관형성작용에 관한 저강도 초음파의 효과를 알아보기로 하였다 실험 방법 및 재료 : 중간엽 줄기세포는 뉴질랜드 흰 토끼로부터 분리하여 단층배양을 하였다. 그 후 배양된 세포는 PGA 지지체(직경: 6mm 두께: 2mm)에 5 × 106씩 분주하여 체외에서 1주일간 배양하였다. 저강도 초음파 군의 초음파 처리는 200mW/cm2의 강도로 매일 15분, 하루 2번씩 1주일간 시행하였다. 1주일간 체외에서 저강도 초음파를 처리한 후 누드 마우스의 피하에 이식하여 1주, 2주, 4주 동안 배양한 뒤 조직학적, 면역형광 분석을 시행하였다. Safranin-O/Fast green의 조직학적 분석을 통하여 Glycosaminoglycan(GAG) 합성 정도를 확인하였으며 Von kossa 염색을 통하여 골 형성 정도를 비교 분석하였다. 연골 조직으로의 분화 정도 확인을 위해 RT-PCR 분석을 시행하였고, 혈관 내피세포에 대한 표지자를 이용하여 면역형광염색을 시행하였으며, 신생혈관형성에 관련된 인자들에 대해서도 면역조직화학 염색을 시행하였다. 결과 : 본 연구에서는 조직학적 검사를 통해 저강도 초음파를 처리한 군에서 체내 배양 시 연골조직으로의 분화가 촉진되는 것을 확인할 수 있었으며, 뼈로의 분화가 지연됨을 확인하였다. 혈관내피세포에 대한 표지자인 PECAM-1의 면역형광염색을 통하여 저강도 초음파를 처리한 군에서 혈관형성이 지연됨을 확인할 수 있었다. 체외 배양기간 동안 저강도 초음파 처리 시간에 따른 영향을 알아보기 위하여 1, 3, 5, 7일 시료를 채취하여 RT-PCR, 면역조직화학염색을 시행하였다. 저강도 초음파를 처리한 군에서 제 2형 교원질 알파 1(Type II collagen alpha 1) 유전자의 발현증가와 MMP-1 유전자의 감소, TIMP-1, TIMP-2 유전자의 발현증가를 통해 연골로의 분화가 촉진됨을 확인할 수 있었으며 HIF-1α, VEGF-A에 대한 면역화학조직염색을 통하여 저강도 초음파를 처리한 군에서 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 결론 : 본 연구를 통해 중간엽 줄기세포의 연골분화 과정 동안 저강도 초음파를 처리하면 연골분화를 촉진하며 골분화가 지연되고 신생혈관 형성에 관여하는 인자들의 발현 또한 억제됨을 확인 할 수 있었다.