메타게놈 라이브러리로부터 새로운 octameric esterase의 클로닝과 특성

Abstract

Metagenome pool로부터 열 안정성을 가지며 (S)-ketoprofen ethyl ester를 광학 분할하는 (R)-form에 비해 (S)-form의 ketoprofen을 많이 생성하는esterase colony 들을 찾았다. 이러한 활성을 보이는 colony 에서 fosmid로부터 얻은 20-30 kb의 insert를 여러 제한 효소로 잘라서 그 활성을 측정하였다. 이에 따라 최종적으로 DNA sequence size가 1170 bp, 단백질 크기가 약42.8 KDa의 esterase (EST-Y29) gene을 찾을 수 있었다. 그리고 찾은 EST-Y29 sequence는 Gene Bank의 DNA Blast 결과 기존의 알려진 esterase와 상동성이 30 % 미만인 새로운 esterase임을 확인하였다. EST-Y29의 최적 pH는 7.0 (phosphate buffer)이며, pH 6.0 (phosphate buffer)이상 에서는 안정함을 보이지만, pH 6.0이하로 갈수록 불안정 해지는 현상을 보였다. EST-Y29의 최적 온도는 65 ℃인 것으로 나타났고, 온도가 낮을수록 (S)-ketoprofen 순수도인 eep (%)는 약99% 까지 높아지는 현상을 보였다. 그리고 EST-Y29의 size를 SDS-PAGE로써 확인해본 결과 약42.8 KDa의 크기로 확인이 되었다. 하지만, EST-Y29 의 native size를 size-exclusion HPLC로 측정해 본 결과 약 8개의 monomer가 합쳐진 형태인oligomer를 형성하는 것으로 보였다. 이러한 구조는 esterase의 열 안정성을 60 ℃까지 높이는 역할을 한 것으로 보인다.