닭의 혈청에서 N-acetyl-β-D-hexosaminidase의 부분 정제 및 특성

Abstract

β-1,4-N-acetylhexosaminidase (N-acetyl-β-D-hexosaminide N-acetyl hexosaminohydrolase, EC 3.2.1.52) (HEX)는 포유류의 리소좀 혹은 비리소좀 hexosaminidases와 진균의 exochitinases, 세균의 chitobiases, 곤충의 chitinolytic hexosaminidases를 포함하며, 일반적으로 N-acetyl-D-hexosaminides에 있는 N-acetyl-D- hexosamine 잔기의 비환원 말단에서의 가수분해를 촉매 한다. HEX는 chitinase와는 달리 β-N-acetylglucosaminidase와 β-N-galactosaminidase의 활성을 모두 가지고 있으며, HEX 분자는 단독으로 진균(21)과 곤충(22)에 대한 저항력을 가지는 것으로 보고되어 미생물과 사람, 동물의 장기와 혈액, 식물 등에서 저분자 항진균제로서의 연구가 활발히 진행되고 있다. HEX는 ganglioside GM2의 감소에도 매우 중요한 역할을 한다고 알려져 있으며, Gaucher disease의 chitotriosidase를 600배 이상 증가 시키는 것으로 보고되어 병인학적으로도 중요하다. 본 실험실에는 가격이 저렴하고 안정적으로 쉽게 구할 수 있는 닭(Gallus gallus L.)으로 chitin분해효소를 분리∙정제해 왔다. 닭의 사료에 chitin, chitosan 등을 첨가하였을 때 성장과 면역이 증가하였다는 연구들이 있으며, 실제로 닭 체내에는 chitin 분해능을 가진 동물성 효소원이 비교적 풍부한 것으로 알려져 있다. 그러나 닭에서의 chitin 분해효소의 분리에 대한 연구는 주로 chitinase를 대상으로 이루어졌으며, 특히 HEX에 대한 연구는 주로 닭 뇌와 난관, 달걀흰자와 달걀껍질막을 대상으로 소수의 연구만이 이루어져왔다. 척추동물 혈청에서의 chitinase 연구는 여러 논문에서 보고된 바 있지만, HEX에 대한 연구는 아직 이루어진 바가 없다. 본 연구에서는 최초로 닭의 부산물이면서도 전처리과정이 거의 필요 없는 혈청(Broiler serum)을 대상으로 ion exchange chromatography와 Con A affinity chromatography, hydrophobic chromatography(HIC), Gel filtration 방법을 이용하여 HEX를 분리․정제하였으며, 또 분리된 HEX의 분자량과 최적 pH, 최적 온도, 열안정성, Vmax와 Km값, 기질 특이성 등의 특성을 알아보았다. 정제된 HEX를 SDS-PAGE를 통하여 확인하였다. 분리된 HEX는 94 배 정제되었으며 yield는 2.6%였고 최적 pH는 4.0, 최적 온도는 60℃로 확인되었다. 기질 4-MU-NAG에 대한 Vmax는 14.9 μmol/hr/mg-protein이었고 Km은 27 μM로 확인되었다. Gel filtration을 통한 분자량은 69 kDa 정도로 측정이 되었다. SDS-PAGE에서 관찰된 두 개의 주 band는 HEX (B 혹은 P)의 homodimer (ββ)를 이루는 β-subunit (69 kDa)과 그것의 이황화결합이 끊어지면서 나온 βa-chain (31 kDa)으로 추정된다. 실제로 닭의 혈청에서 HEX는 142 kDa의 분자량을 가진 dimer로 존재할 것으로 보인다. 최종적으로 분리된 HEX를 [3H] chitin을 기질로 하여 chitin 분해능을 측정한 결과 6.77 ㎍/㎎ protein/h이었으며 정제된 HEX가 endochitinase의 활성도 가짐을 알 수 있었다.