재조합 섬유성 알파 시누클레인을 이용한 세포내 응집체 모델 시스템 구축

Abstract

파킨슨병은 중뇌의 흑질치밀부(Substantia nigra pars compacta)에서 도파민성 신경세포의 점진적인 소실을 특징으로 하는 질병이다. 이러한 파킨슨병의 특징은 루이 소체(Lewy body, LB) 및 루이 신경돌기(Lewy neurites, LN)이라고 알려진 응집체가 존재하며, 이러한 응집체를 구성하는 주요 구성요소는 알파-시누클레인(α-synuclein)이라고 알려져 있다. 많은 보고와 결과들은 알파-시누클레인으로 구성된 응집체들이 인접한 신경 세포에 전파되어 파킨슨병의 진행을 초래하는 것을 나타낸다. 고속 대량 약물 스크리닝을 위한 세포 내 모델 시스템을 개발하기 위해, 우리는 A53T-α-syn-EGFP를 발현하는 안정적인 세포주를 생성하고, 미리 형성된 재조합 α-syn 섬유(PFF)를 용량 및 시간별로 처리했다. 확인한 결과 용량 및 시간 의존적 방식으로 PFF를 처리하여 A53T-α-syn-EGFP 응집체의 형성을 관찰했다. 형성된 응집체를 세포당 응집체의 수, 응집체의 평균 크기, 응집체의 평균 형광 세기, 응집체를 가지는 세포의 비율 등 다양한 방법으로 응집체를 분석하였다. 세포당 응집체의 수와 응집체를 가지는 세포의 비율은 낮은 농도의 PFF에서 증가한 반면, 응집체의 평균 크기와 평균 형광 세기는 높은 농도의 PFF에서 증가했다. PFF 처리된 A53T-α-syn-EGFP 세포에 pSer129 알파-시누클레인 항체를 염색했을 때, 모든 응집체가 pSer129 알파-시누클레인 항체로 염색되지는 않았다. A53T-α-syn-EGFP의 응집체와 pSer129 알파-시누클레인의 공동 국소화는 시간 의존적 방식으로 증가하고, 초기 응집 후 pSer129 알파-시누클레인이 발생함을 확인하였다. 또한, 자가포식기전을 억제했을 때, 응집체가 증가하는 것을 확인했고, 활성시켰을 때, 응집체가 감소하는 것을 확인하였다. 알파-시누클레인의 전파를 억제한다고 보고한 c-src 유전자를 넉다운 시켰을 때와 c-src 억제제인 사라카티닙을 사용했을 때, 응집체의 형성이 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 것을 바탕으로 이 모델 시스템은 짧은 시간에 알파-시누클레인 응집체의 형성을 모니터링하고 고속 대량 약물 스크리닝으로 사용하는데 도움이 될 것이다.