Cytochrome P450 monooxygenase-mediated synthesis of α,ω-diol monomer and aromatic biopolymer

Abstract

본 연구는 사이토크롬 P450(CYP) 효소의 위치특이적 수산화 활성을 바이오폴리머 합성 분야에 활용한 연구를 다루고 있다. CYP 효소를 사용해 바이오플라스틱 단량체인 α,ω-도데칸다이올과 신규 멜라닌 바이오 폴리머를 생합성하였다. 사이토크롬 P450 수산화 효소는 기질의 위치특이적 수산화 반응을 위한 생촉매로 사용될 수 있으며 기질의 특정 위치에 수산화기를 치환할 수 있다는 점에서 화학적 합성에 비해 이점을 갖는다. 도데칸다이올은 폴리에스터, 폴리우레탄 등의 고분자 단량체로 활용할 수 있고, 산화반응 또는 아미노기 전이반응을 등을 통해 다른 종류의 고분자 단량체로 전환이 가능한 바이오 플라스틱 산업에서 활용도가 높은 물질이다. 대장균 내에 ‘기질 유입 효소-CYP효소-전자전달효소’ 발현 시스템을 모듈화하여 구축하였으며, 1-도데칸올에 대한 omega 위치 특이적 수산화 활성을 갖는 CYP 효소를 전세포반응을 통해 선별하고 도데칸 기질의 omega 수산화 성능 또한 평가하였다. 그 결과, 1-dodecanol과 dodecane에 대한 위치 특이적 수산화가 가능한 효소 CYP153A33과 Nfa22290을 선별하는 데 성공하였으나 전환 수준이 약 23%로 높지 않았고, 과산화(overoxidation) 부산물인 도데칸산이 생성물의 약 10%를 차지하는 한계가 있었다. α,ω-다이올로의 기질전환 비율을 높이기 위한 목적으로 CYP153A33 효소의 돌연변이를 제작하였다. CYP153A33-도데칸올 결합 시뮬레이션을 통해 도출한 모델을 기반으로 하여 구조를 분석하였다. 기존의 CYP153A33 효소 구조변이 관련 선행연구는 기질과 직접 결합하는 수산화 활성부위에 집중되어 이루어졌으나, 본 연구에서는 수산화활성 부위와 더불어 기질이 효소 내부로 유입되는 메커니즘에 집중하였고, 효소 표면구조의 loop가 기질의 유입에 영향을 미칠 수 있음을 증명하였다. Loop를 구성하는 아미노산 서열 중 Proline 135-Proline 136 연속 구조가 loop의 기질유입 핵심부위에 위치함을 확인하였고 이로 인해 유발되는 rigidity를 줄이기 위해 proline 136을 alanine으로 치환함으로써 기질의 유입을 용이케 하였다. 이로써 1-도데칸올의 생전환율을 약 71% 수준으로 3배 이상 높였으며, 그 중 도데칸산이 차지하는 비율은 1% 미만으로 낮추어 CYP153A33 효소의 활용가치를 높였다. Tyr-멜라닌은 아미노산 L-타이로신으로부터 타이로시네이즈 효소 반응으로 전합성이 가능한 바이오폴리머이다. 타이로신을 시작물질로 한 도파크롬 유도체 단량체가 무작위 중합된 형태로, conjugation 구조이며 짙은 갈색을 띄는 특징이 있기 때문에 전자전달이 가능하고 유기반도체 소재, 흑색 유기안료, 자외선 차단 물질 등으로 응용이 가능하다. 무작위 중합으로 고분자의 정확한 구조를 알 수 없는 한계점이 있지만 단량체 구성을 변경하는 방식으로 응용처를 확장해볼 수 있는 가능성이 있는 물질이다. L-트립토판을 시작물질로 하는 indoxyl 유도체를 단량체로 포함시키는 전략으로 기존과 차별된 물성을 갖는 신규 멜라닌을 합성하고자 하였다. 사용한 효소는 CYP102G4로 인돌의 3번 탄소에 위치 특이적으로 수산화를 하는 CYP 효소로, 도파크롬 단량체를 중합하는 타이로시네이즈 효소의 촉매 작용이 가능할 것으로 생각되었다. 새롭게 적용된 CYP102G4 효소와 기존의 Tyr-멜라닌 합성 생촉매인 타이로시네이즈를 동시발현하여 대장균 내에서 신규 멜라닌 합성 경로를 구축하여 생합성하였고, 결론적으로 Tyr-멜라닌 대비 짙은 흑색에 가까운 색의 CYP-멜라닌을 합성하는 데 성공하였다. 멜라닌 생성량 또한 기존의 리터당 수백밀리그램 수준에서 3g 이상으로 크게 증가하였으며, 공극률과 표면적이 높진 않지만 전극물질로써 활용 가능성을 확인하였다. 또한 FT-ICR 분석을 통해 신규 멜라닌이 기존에 비해 높은 비율로 황원소를 포함하는 것을 확인하였다. 결론적으로 본 연구는 CYP 효소를 다이올 형태의 고분자 단량체 및 신규 멜라닌 고분자 생합성에 활용하여 효소의 응용처를 확장하였으며, CYP 효소의 구조 및 기질결합 메커니즘에 기반한 개량을 통해 위치특이적 수산화 활성을 증대함으로써 CYP의 응용과 개량에 관한 학문적 기반을 제공했다는 점에서 의의가 있다. 주요어: P450 효소 (CYP 효소), 위치특이적 수산화, 바이오 단량체, 바이오 폴리머, 도데칸다이올, 멜라닌