세포 노화에서 DNMT1의 하위 조절자로서 SPINT2 작용 기전 연구

Abstract

복제 노화(replicative senescence)가 진행될 때, 세포는 시기에 따라 서로 다른 많은 유전자들의 발현이 변화함과 동시에 다양한 노화 표현형을 획득한다. 이전 연구에서 여러 유전자 발현을 동시에 조절할 수 있는 DNMT1이 복제 노화의 초기 단계에 하향 조절되어 유전자 재프로그래밍을 관장함으로써 후속 노화 표현형의 마스터 조절자로 작용함을 확인하였고, 6개의 핵심적인 하위 타겟 유전자를 발굴하였다. 본 연구에서는 DNMT1의 하위 유전자 중 SPINT2를 중심으로 유전자조절 및 노화조절 기전을 밝히고자 하였다. 먼저 복제 노화 모델에서의 유전자 발현 패턴과 발현 상관성 분석을 통하여 DNMT1와 SPINT2가 서로 상반되는 상관관계(negative correlation)을 가지고 있음을 확인하였다. 이러한 DNMT1의 발현감소와 SPINT2의 발현증가 패턴은 복제 노화과정에서 senescence-associated β-galactosidase(SA-β-gal) 활성도 없이 세포크기 및 cell granularity가 증가하는 초기 단계부터 나타남을 확인하였다. 또한 산화스트레스 노화모델에서도 공통적으로 나타나는 중요한 현상임을 확인하였다. DNMT1의 활성저해제인 5-aza-2'-deoxycytidine(5-AzC)을 이용하여 활성을 억제하거나 siRNA를 이용하여 DNMT1의 발현을 억제시켰을 때, SPINT2의 mRNA와 단백질 양이 증가하고 cellular senescence가 유도됨을 확인하였다. 또한 두 유전자의 siRNA를 이용한 발현억제 및 Lentivirus를 이용한 SPINT2 과발현을 통해 DNMT1이 SPINT2의 상위조절자임을 확인하였으며, SPINT2의 과발현만으로도 노화가 유도됨을 확인하였다. 또한 DNMT1의 감소가 어떻게 SPINT2를 조절하는지 확인하기 위하여 2kb 길이의 SPINT2 promoter DNA를 가지는 luciferase 리포터 벡터를 제작하였고, deletion 형태를 제작하여 promoter 활성을 분석함으로써 assay를 통해 siRNA를 이용한 DNMT1의 감소 시 SPINT2의 promoter activity의 증가를 측정함으로써 DNMT1이 작용하는 특정 promoter 부위를 확인하였다. SPINT2는 HGF/c-Met 신호 경로를 조절한다고 알려져 있어서, SPINT2의 과발현 후 c-Met의 phosphorylation 상태를 확인하였을 때, 인산화가 감소하는 것을 확인하였고, siRNA를 통한 c-Met의 감소만으로도 노화가 유도됨을 확인하였다. 유전자 발현 프로파일링 분석을 통하여 c-Met의 하위조절자를 분석하고 mRNA 양을 검증하여 3개의 gene(COL27A1, STAM2, CBL)가 SPINT2 과발현에 의해 조절됨을 확인하였다. 이와 같은 결과를 바탕으로 DNMT1의 감소가 SPINT2를 증가시키고, HGF/c-Met 신호체계를 억제하여 노화 표현형을 유도한다는 결론을 도출하였다. 본 연구결과로 DNMT1이라는 노화의 초기 조절자가 SPINT2/HGF/c-Met 신호체계를 조절하여 노화를 조절하는 핵심 유전자임을 증명하게 되었다.