Construction of natural biosynthesis pathway of crocins and non-natural biosynthesis pathway of crocetin dialdehyde, in metabolically engineered Escherichia coli

Abstract

대사공학 및 합성생물학 기술의 발달로 천연화합물, 바이오연료, 의약품, 식품, 화장품 등 다양한 산업에서 미생물을 이용하여 귀중한 천연물을 생산하고 있다. 주로 식물과 미생물에서 유래하는 테르페노이드, 카로티노이드 등 다양한 이소프레노이드계 물질의 생산에 대한 연구가 진행되고 있다. 최근에는 크로커스 사티버스(Crocus sativus)의 암술머리에서 유래한 천연 카로티노이드 산물인 크로신과 그 중간체인 크로세틴에 대한 연구가 진행되고 있는데, 이는 항암, 항고지혈증, 항우울제, 항산화 효과 등 다양한 생리학적 특성을 지닌 천연 색소이다. 이 연구는 크로세틴과 크로신(crocin-1, -2, -3, -4)의 생산에 초점을 맞추었다. 비천연 카로티노이드 생합성 경로가 확립되어 다양한 신규 짧은 카로티노이드 및 크로세틴 디알데하이드를 생산한다. 이것은 제아잔틴 생합성 경로로 대장균을 도입함으로써 달성되었다. 크로커스 사티버스 절단 디옥시게나제 (CsCCD2), 알데히드 탈수소효소, 식물유래 글리코실트랜스퍼라제 등을 발굴하여 도입하였으며, 크로신 생합성 경로 구축을 통해 크로신을 생합성 하였다. CsCCD2, 시네코시스티스 sp. PCC6803 유래 크로세틴 디알데하이드 탈수소효소(ALD6803), 시네코시스티스 sp. PCC7942 유래 크로세틴 디알데하이드 탈수소효소(ALD7942)가 재설계되고 재구성되어 제아잔틴을 생산하는 대장균(ZEA-1)에 도입되었습니다. 최적의 배양 온도 조건에서 CsCCD2는 크로세틴 디알데하이드 (5.14 ± 0.28 mg/L)를 생성하여 ALD가 크로세틴 합성을 촉매했음을 보여줍니다. CsCCD2 및 ALD의 발현 모듈을 최적화하여 크로세틴의 생산이 증가했습니다(34.77 ± 1.03 mg/L). 그런 다음 다양한 출처의 UDP-글리코실트랜스퍼라제(UGT)를 시험관 내 효소 활성에 대해 스크리닝했습니다. 스크리닝을 통해 선별한 해당 UGT 유전자를 이용하여 크로세틴을 생산하는 대장균 균주에 도입하였다. 그 결과, crocin-1(6.29 ± 0.19 mg/L), crocin-2(5.29 ± 0.24 mg/L), crocin-3(1.48 ± 0.10 mg/L), crocin-4(2.72 ± 0.13 mg/L)을 회분식 발효를 통해 생산할 수 있었다. 마지막으로 크로신을 생산할 수 있는 새롭고 단축된 대사 경로를 제안하기 위해 천연 크로세틴 디알데하이드 생합성 경로를 사용하는 대신 비천연 생합성 경로를 단축하여 크로세틴 디알데하이드를 함유하는 C20 및 C25 카로티노이드를 생산했습니다. Halobacillus halophillus 유래 4,4'-디아포피토엔 합성효소(CrtMLIKE)의 예측된 단백질 모델링을 위해 기질 포켓 부피를 줄이기 위해 부위 지정 돌연변이 유발을 수행했습니다. 표적 아미노산 잔기는 부피가 큰 아미노산 잔기로 대체되었고, 조작된 돌연변이체가 구축되고 향상된 전구체 생산을 갖는 플랫폼 균주에서 발현되었다. 이것은 대장균에서 비천연 짧은 카로티노이드 골격(C20 및 C25-파이토엔)을 갖는 새로운 구조의 생합성으로 이어졌습니다. 황색포도상구균 유래 디아포피토엔 불포화효소(CrtN)와 황색 포도구균 유래 4,4'-디아포뉴로스포렌 산화효소(CrtP)를 도입하여 C20 및 C25 카로티노이드 경로를 추가로 확장하여 대장균에서 5개를 포함한 8개의 새로운 구조의 생합성을 이끌었습니다. 새로운 구조의 5개의 불포화된 카로티노이드와 크로세틴 디알데하이드가 포함된 새로운 구조의 산소화된 말단을 지닌 3개의 카로티노이드를 대장균에서 생합성 하였다. 결론적으로 합성유전자의 발현과 배양온도를 조절함으로써 크로세틴 생산을 증가시켰고, 이종식물 유래 글리코실트랜스퍼라제를 이용한 천연 크로신 생합성 경로를 통해 크로신을 생산하였다. 비천연 짧은 카로티노이드를 합성하기 위해 전구체 생산이 향상된 균주가 조작되었고, 아미노산 잔기의 치환에 의해 기질 포켓 부피가 감소된 카로티노이드 합성효소가 조작되었습니다. 또한, 경로를 추가로 확장하면 경로를 추가로 확장하여 크로세틴 디알데하이드를 포함한 8가지 새로운 유형의 비천연 짧은 카로티노이드의 생합성을 가능하게 했습니다. 이 연구는 대장균에서 크로신에 대한 생합성 경로의 구성 및 생산을 보고한 최초의 연구입니다. 또한 생합성 경로를 단축하여 생산한 크로세틴 디알데하이드의 통해 탄소 소비를 줄일 수 있음을 입증한 최초의 연구입니다. 크로신 생산을 위한 이 새로운 생합성 효소 발견 플랫폼과 단축된 카로티노이드 생합성 경로의 엔지니어링은 잠재적으로 유용한 생물학적 및 화학적 효과를 지닌 새로운 짧은 카로티노이드 구조의 추가 생산으로 이어질 수 있습니다.