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Cleavage of MLKL at brace region through activation of caspase 3
- Author(s)
- 박상영
- Alternative Author(s)
- Sang-Yeong Park
- Advisor
- 김유선
- Department
- 일반대학원 의생명과학과
- Publisher
- The Graduate School, Ajou University
- Publication Year
- 2022-08
- Language
- eng
- Abstract
- 현재까지 보고된 바에 따르면, MLKL은 Necroptosis라고 불리는 세포괴사 기작 중 활성화되는 RIP3에 의해서 인산화 되어 조절되는 필수적인 작동인자로 잘 알려져 있습니다. MLKL은 RIP3에 의해 MLKL의 슈도카이네이즈 (pseudokinase)가 인산화 되면 brace region을 통해 연결되어 있는 4HB(four helix bundle)이 세포막의 파괴를 유발할 수 있는 활성화 형태로 변형합니다. Brace region은 메싸이오닌 (Methionine)과 트립토판 (Tryptophan)을 통해 4HB과 결합함으로써 기능을 억제하는 자가 억제 (잔기 122-149) 역할과 MLKL의 올리고머화 (149-180)에 기여합니다. 여기서 저는 세포사멸 (Apoptosis) 조건에서 MLKL이 절단되는 것을 확인하였고, 생성된 단편의 크기와 사용된 항체의 특이성을 통해서 MLKL-N-말단의 brace region에서 절단된다는 것을 발견하였습니다. 또한 MLKL의 brace region에서 caspase3에 의해 절단될 수 있는 인식 부위를 추정하였고, 이를 실험을 통하여 MLKL의 아스파트산 (Aspartic acid) 140(D140)이 세포사멸에 의해서 활성화된 caspase3에 의해 절단되는 부위라는 것을 확인하였습니다. 절단된 MLKL (1-140)의 발현은 TRAIL에 의해 유도되는 세포사멸에서 대조군 세포에 비해 세포사멸이 증가하지 않는 것을 통해 MLKL의 D140 절단에 의해 생성된 단편은 세포독성을 갖지 않는 다는 것을 입증하였습니다. 여기에 더해서 caspase3에 의해 생성된 MLKL-N-말단 단편은 올리고머화에 필요한 두 번째 brace 나선이 없기 때문에 올리고머화 할 수 없지만, 이러한 단편이 세포질, 원형질막 및 핵으로 전위되어 있는 것을 확인하였습니다. 이는 MLKL (1-140)의 양전하 잔기인 K5, K16, K17, K50 및 K51이 막 인지질의 음전하와의 상호작용을 통한 결합을 시사합니다. 이는 향후에 세포막과 핵으로 이동한 MLKL-N-말단 단편이 다른 단백질과의 상호작용을 통한 기능과 다른 세포 구획에서의 역할에 대한 연구의 필요성을 제시합니다.
- Alternative Abstract
- Mixed Lineage Kinase Domain-like (MLKL) is the most downstream known essential molecule of necroptosis, a cell death process that is initiated by direct disruption of the plasma membrane. During this process, MLKL is believed to induce a conformational change through phosphorylation by Receptor Interacting Protein Kinase-3 (RIPK3 or RIP3). RIPK3-mediated phosphorylation MLKL leads to unleashing of the N-terminal executioner four-helix bundle (4HB) domain (NED) which is connected by a two-helix brace (B) to the C-terminal pseudokinase domain (psKD). Regulatory brace contributes to autoinhibition (residues 122-149) and oligomerization (149-180) in MLKL. Human NED (hNED) NMR structure reveals that the inhibitory linker is anchored to NED by methionine and tryptophan. An additional NED linker helix creates a pocket to accommodate a phenylalanine and conserved 5 acidic-basic electrostatic interaction stabilizes stabilize autoinhibited NED at the C-terminus of the brace in a dormant state. Here I found that under apoptotic conditions, MLKL is cleaved, and the size of the generated fragment and the specificity of antibodies used suggested a cleavage at the brace region of MLKL. I found that MLKL protein contains putative caspase-3 recognition motif in brace region and identified aspartic acid 140 (D140) as the cleavage site by caspase-3, which forms a salt bridge represents one of a series of conserved 5 acidic-basic electrostatic interactions between residues in helix α2 of the NED and the autoinhibitory region of brace. The expression of MLKL residues 1-140 did not result in increased cell death relative to the control cells, demonstrating that the fragments generated by D140 cleavage are not inherently cytotoxic. Caspase-3 generated MLKL-N-terminal fragments were not able to oligomerize, owing to the absence of the second brace helix that is required for oligomerization. Although MLKL 1-140 is non-toxic, but these fragments localize plasma membrane, cytosol and nuclear suggesting that positively charged surface residues of NED, including K5, K16, R17, K50, and R51 bind negatively charged polar head groups of membrane phospholipids. Future work will elucidate what MLKL-N-terminal fragments interplay with other proteins or play a role in different cellular compartments.
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- Appears in Collections:
- Graduate School of Ajou University > Department of Biomedical Sciences > 3. Theses(Master)
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