Biomaterial-based therapies for spinal cord repair

Abstract

척수는 우리 몸의 모든 부분과 뇌 사이의 신경신호를 축삭 (axon)을 통해서 전달한다. 교통사고나 낙상과 같은 물리적 손상이 척수에 가해지게 되면 신경신호를 전달할 수 없으므로 신경회로망의 손상과 함께 신경학적 기능 소실이 발생한다. 중추신경계인 척수의 성숙한 신경세포는 한 번 손상을 받게 되면 자발적인 재생을 거의 하지 못하기 때문에 척수손상 환자의 영구적인 기능적인 장애를 일으킨다. 중추신경계 신경세포가 한 번 손상을 받으면 재생을 하지 못하는 이유는 크게 신경세포의 내재적 축삭 재생능이 부족한 점과 척수손상 부위의 축삭재생을 저해하는 세포외기질 (extracellular matrix)과 같은 손상부위의 주변 환경때문이다. 척수손상 주위의 척수재생을 저해하는 다양한 환경 요인중에서 대표적인 요소는 낭포성공동 (cystic cavity)이다. 낭포성 공동은 척수손상 부위에 이차적 조직변성 과정에서 발생되는데, 척수손상 후 발생되는 조직학적 특징 중 중에 하나이며 손상 부위내에 뇌척수액 (cerebrospinal fluid)으로 가득차게 되는 병태생리학적 특성을 보인다. 이러한 낭포성공동은 시간이 지남에 따라 일정기간까지 점점 커지게 되고, 낭포성공동 안에는 세포가 부착하여 생존할 수 있는 세포외기질이 존재하지 않으므로 신경세포뿐만 아니라 모든 다른 세포들도 생존을 할 수 없는 공간이다. 낭포성공동 안에는 신경세포의 축삭이 재생하는데 필수적인 세포외기질이 존재하지 않으므로 신경재생을 저해하는 대표적인 인자이다. 또한, 척수손상 부위 세포외기질의 부재는 세포이식과 같은 척수손상 치료에도 큰 장애물로 여겨지고 있다. 따라서, 많은 연구자들이 이러한 낭포성공동을 억제하기 위하여 척수손상 동물모델에서 다양한 연구를 진행해왔지만 이를 완전히 억제할 수 있는 특별한 해결책이 제시되지 못하였다. 지난 2017년 본 연구실의 이전 연구에서 온도감응성 하이드로젤 (I-5)을 이용하여 동물척수손상 모델에서 낭포성공동 형성을 완전히 억제하는데 성공하였다. 하이드로젤을 척수손상 후 1주일뒤에 손상부위에 주사를 하였고, 4주뒤에 조직학적 결과를 관찰하였다. 그 결과 하이드로젤을 주사하지 않은 그룹에서는 큰 낭포성공동에 의한 tissue defect가 관찰된 반면에, 하이드로젤을 주사한 그룹에서는 피브로넥틴 (fibronectin) 양성의 새로운 세포외기질이 생성되었다. 피브로넥틴 양성의 매트리스에는 다양한 표현형의 대식세포가 관찰되었다. 지난 연구에선 대식세포와 하이드로젤내의 imidazole moiety의 활발한 상호작용에 의해서 세포외기질이 만들어졌다는 것을 증명하였다. 척수손상에 의한 신경학적 기능소실을 회복하기 위해서는 손상된 부위에 하이드로젤 주사에 의해서 새로 생성된 세포외기질 안으로 신경세포의 축삭이 새로 자라고, host 신경세포와의 neural circuit을 재형성해야 한다. 하지만, 하이드로젤 주사에 의해서 생성된 피브로넥틴 양성의 세포외기질 내부로 신경세포의 축삭이 재생이 되는지에 대한 추가 연구가 이루어지지 않았다. 본 학위논문의 첫 번째 파트로, 본 연구자는 척수손상에 의해서 손상된 신경세포의 축삭이 하이드로젤 주사에 의해서 생성된 세포외기질 내부로 신경세포가 재생을 할 수 있는지를 평가하였다. Neurofilament, serotonergic 양성의 축삭이 하이드로젤 주사에 의해서 생성된 세포외기질 내부에서 다소 적은 수가 관찰되었다. 또한, 신경기능학적 움직임과 관련되어 있는 요추척수의 serotonergic 양성 축삭을 관찰한 결과 비교군인 PBS 주사그룹에 비해서 I-5 하이드로젤 주사그룹에서의 축삭이 더 많이 관찰되었다. 그 외에도 신경세포의 재생능을 분석하기 위하여 anterograde tracing을 실시한 결과 피질척수로 (corticospinal tract axon)의 축삭재생은 하이드로젤 주사에 의해서 생성된 세포외기질 내부로 재생을 하지 못하였지만, biotinylated dextran amine (BDA)을 이용한 다른 descending tract 신경축삭은 추적 결과 일부 신경세포의 재생이 하이드로젤 내부로 자라는 것을 관찰하였다. 하지만, 기대했던 것과는 달리 신경세포의 재생이 새로운 매트리스 내로 잘 자라지 못한다라는 결론을 내렸다. 본 학위논문의 두 번째 파트에서는 첫 번째 파트에서의 후속연구로 하이드로젤 주사에 의해서 생성된 세포외기질의 병태생리학적 분석 및 신경세포 축삭재생 촉진 전략을 제시하였다. 하이드로젤 주사에 의해서 생성된 세포외기질에는 신경세포의 축삭재생을 억제한다고 잘 알려진 CSPGs (chondroitin sulfate proteoglycans)가 피브로넥틴 양성 matrix와 같이 침착되어 있음을 확인하였다. 따라서, CSPGs를 억제하기 위하여 아릴설파타아제 (arylsulfatse b)라는 효소를 이용하였다. 아릴설파타아제는 면역거부 반응이 적은 장점이 있는 것으로 알려져 있고, 축삭의 재생을 저해한다고 잘 알려진 CSPGs의 C4S (chondroitin-4-sulfate) 곁사슬 부분을 타겟으로 한다. 먼저, 시험관내 섬유화모델을 확립하여 CSPGs가 transforming growth factor beta1 (TGF beta1)처리에 의한 activated fibroblast의 피브로넥틴 (fibronectin) 매트리스 침착과 세포의 clustering을 좀 더 유도하는 것을 확인하였다. 다음으로 아릴살파타아제의 효능을 시험관 내 섬유화모델 내에서 먼저 확인을 하고, 동물 척수손상 모델에서 하이드로젤과 아릴설파타아제 혼합주사를 통한 효능을 검증하기 위한 실험을 하였다. 그 결과, 아릴설파타아제를 혼합주사한 그룹에서 척수손상 부위에서 CSPGs의 생성저해를 확인하였고 신경세포의 다양한 축삭들이 매트리스 안으로 더 자라는 것을 관찰하였다. 또한, 이러한 결과는 동물의 신경학적 보행능력 향상에 기여함을 확인하였다. 본 학위논문의 세 번째 파트에서는 하이드로젤을 신경줄기세포의 매개체 (carrier)로의 가능성을 제시하였다. 척수손상 치료의 방법으로 다양한 연구가 진행되고 있는데, 그 중에서도 손상된 신경회로망을 재건하기 위하여 척수유래 신경줄기세포 이식이 활발하게 이루어지고 있다. 이식된 신경줄기세포가 신경세포로 분화를 하여 host와의 재연접을 할 수 있다는 점에서 큰 기대를 모으고 있다. 하지만, 척수손상 부위의 해로운 환경 때문에 이식된 신경줄기세포의 매우 저조한 생존율이 세포유래의 척수손상 치료전략에서 큰 문제로 대두되고 있다. 본 연구자는 하이드로젤과 신경줄기세포를 혼합 주사를 하게 되면 하이드로젤에 의해서 생성된 새로운 매트리스가 이식된 신경줄기세포의 생존을 증가시킬 수 있을 것이라는 가설을 세웠다. 하지만 기대와는 다르게 줄기세포의 저조한 생존율을 확인하였다. 이전 문헌에 따르면, 생체물질, 하이드로젤의 기계적인 강도는 세포의 부착, 생존, 분화와 같은 세포의 생물학적 반응에 큰 영향을 끼친다는 보고가 있다. 이와 관련하여 본 연구자는 하이드로젤의 기계적인 강도를 조절하면 하이드로젤과 함께 이식된 줄기세포의 생존율을 조절시킬 수 있을 것이라는 가설을 세웠다. 본 가설을 증명하기 위하여 먼저 시험관내 실험모델을 설립하였다. 기계적인 강도가 다른 하이드로젤 배양접시에 신경줄기세포를 배양한 결과 더 단단한 하이드로젤 배양접시에서 키운 세포가 더 높은 세포부착능, 세포질 확장, 생존율을 보였다. 또한, 신경줄기세포에서 기계적강도에 반응하는 수용체가 많이 발현하는 것을 확인하였고, 이와 관련된 칼슘이온들이 단단한 배양접시에서 키운 신경줄기세포에서 더 활발하게 이루어지는 것을 확인하였다. 기계적강도 수용체의 억제제를 같이 처리한 결과 단단한 배양접시에서 보인 생존율과 부착능이 감소한 것을 확인하였다. 시험관내 모델의 결과를 바탕으로 동물척수손상 모델에 농도가 다른 I-5하이드로젤과 신경줄기세포를 혼합이식하였다. 그 결과 놀랍게도, 하이드로젤의 농도가 더 높아질수록 신경줄기세포의 생존율이 크게 증가하였다. 또한, 살아있는 세포의 양적인 비교를 해보았을 때, 16%의 고농도 하이드로젤과 신경줄기세포를 혼합 이식하였을때, 살아있는 세포의 양과 세포가 관찰된 면적이 10%의 하이드로젤과 신경줄기세포를 혼합 이식하였을때와 비교해서 현저하게 증가함을 확인하였다. 종합적으로, 본 연구자는 이번 박사학위연구를 통해 생체물질 (하이드로젤)을 이용하여 척수손상 이후에 발생되는 낭포성 공동을 억제하였고, 하이드로젤 주사에 의해서 생성된 새로운 매트리스가 신경세포의 축삭이 더 자랄 수 있도록 아릴설파타아제를 이용하여 미세환경을 조절하였다. 또한, 하이드로젤의 농도가 신경줄기세포의 이식생존율과 밀접하게 관련이 있다는 것을 발견하였다. 향후 이러한 연구결과가 척수손상뿐만 아니라 다른 중추신경계 질환 치료연구의 다양한 생체물질에도 적용이 될 수 있길 기대한다.

핵심어: 척수손상, 신경 축삭재생, 아릴설파타아제, 주사형 하이드로젤, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글라이칸, 섬유성 미세환경, 세포이식