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Ratiometric Two-photon Fluorescence Probes for Carboxylesterase Activity and Cellular Polarity
| DC Field | Value | Language |
|---|---|---|
| dc.contributor.advisor | 김환명 | - |
| dc.contributor.author | 박상준 | - |
| dc.date.accessioned | 2022-11-29T02:32:14Z | - |
| dc.date.available | 2022-11-29T02:32:14Z | - |
| dc.date.issued | 2020-08 | - |
| dc.identifier.other | 30110 | - |
| dc.identifier.uri | https://dspace.ajou.ac.kr/handle/2018.oak/19737 | - |
| dc.description | 학위논문(박사)--아주대학교 일반대학원 :에너지시스템학과,2020. 8 | - |
| dc.description.abstract | 형광 현미경 기반의 이미징 기술은 높은 해상도 및 감도, 낮은 비용 및 실시간 영상이 가능하다는 다양한 장점이 있어 오늘날 살아있는 세포 및 조직에서 생명 현상을 이해하기 위한 필수적인 이미징 기술로 자리매김하였다. 공초점 및 이광자 현미경이 개발됨에 따라 광학 현미경으로 관찰할 수 없었던 세포 수준에서부터 작은 동물에 이르기까지 복잡한 생물학적 그리고 병리학적 현상을 관찰하고 이해할 수 있게 되었다. 그러나 이러한 형광 이미징 기술의 발전에도 불구하고 정량적인 분석에 적합한 형광 소자의 개발은 여전히 제한적이기 때문에 정밀 진단 및 영상화 연구에는 한계가 있다. 이 논문은 정량적인 분석을 위한 형광 프로브의 개발 전략 및 살아있는 세포와 조직에서의 효소 활성과 극성의 변화를 정략적으로 검출하기 위한 가변색 프로브의 연구를 소개한다. 카르복실에스터라제는 (CEs) 다양한 기질의 에스터 결합을 가수분해하는 효소군으로써, 그 중 카르복실에스터라제-1과 (CE1) 카르복실에스터라제-2가 (CE2) 체내에 존재하는 대표적인 효소이다. 이 두 효소는 체내에 분포하는 위치가 다르며 이 중 간에서의 CE1의 결핍은 간 질환 및 지질대사의 장애를 유발하며, 체내의 CE2의 비정상적인 활성은 다양한 암의 발현과 밀접한 관련이 있다고 알려져 있다. 또한 CE1과 CE2는 항암제를 비롯한 다양한 의약품의 약리 작용에도 관여한다. 따라서 살아있는 세포 및 조직에서 CE1과 CE2의 활성을 정략적으로 검출할 수 있는 형광 프로브를 개발한다면, 다양한 질병의 진단 뿐만 아니라 약리학적 작용을 분석하는데도 유용하게 사용될 수 있을 것이다. 본 연구에서는 가수 분해됨에 따라 청색에서 황색으로 형광 파장이 달라지는 가변색 CEs 프로브를 (SE1) 개발했다. 이 프로브는 상용화 된 CEs 프로브와 (FDA) 유사한 반응 속도를 가졌지만, 생리학적 환경에서 화학적으로 훨씬 더 안정하며 높은 광안정성을 가지고 있어 살아있는 세포 및 조직에서 장시간 효소의 활성을 분석할 수 있었다. 또한 후속 연구로써 SE1의 가수 분해 부위를 개선하여 CE2에 선택적인 가변색 측정 프로브를 (Probe1 및 Probe2) 개발했다. 특히 Probe2는 이미징 조건에서 높은 광안정성을 가지고 있어 살아있는 세포에서 CE2 활성을 정량적으로 관찰할 수 있었으며, Probe2를 이용하여 다양한 대장암 세포에서의 CE2 활성을 정량적으로 분석할 수 있었다. 나아가 이전까지 보고된 적 없는 유방세포에서 CE2의 활성을 검출하여 유방암 세포에서의 CE2의 활성이 정상세포에서 보다 훨씬 낮다는 것을 밝혀냈다. 세포의 항상성은 극성, 점도, 온도, 산화 환원 상태 및 pH 등 다양한 요인의 화학적 상호작용에 의해 유지된다. 그 중 세포 내 극성은 면역 조절, 세포 증식 및 분자의 수송을 포함하여 다양한 생명 현상에서 중요한 역할을 한다. 세포내 다양한 소기관은 각 역할 및 세포내 환경의 변화에 따라 최적의 극성을 가지게 되며, 비정상적인 세포의 극성은 신경계 질환, 당뇨병 및 암을 유발한다. 따라서 세포의 극성을 연구하는 것은 세포의 병리학적 거동을 연구하는데 대단히 중요하다. 비록 다양한 극성 검출 프로브가 보고되었으나 대부분의 프로브는 주변 환경의 극성이 증가함에 따라 형광 효율이 급격하게 감소하여 소수성의 좁은 영역의 극성만을 관찰할 수 있다는 단점이 있다. 또한 보고된 대부분의 프로브는 세포내 특정 소기관에만 염색됨으로써 세포의 전반적인 극성을 관찰하는데 한계가 있다. 이러한 한계를 극복하고자 본 연구에서는 극성이 증가함에 따라 '턴-온' 되는 프로브 (Dye1)와 '턴-오프' 되는 (Dye3) 두 가지 프로브를 하나의 프로브로 결합함으로써 넓은 영역의 극성을 정량적으로 검출할 수 있는 새로운 가변색 프로브 (RPS-1)를 개발했다. Dye1과 Dye3은 비슷한 흡수 파장을 가지고 있지만 두 프로브의 스토크 쉬프트가 달라 Dye1과 Dye3은 각각 황색 및 적색 영역의 형광을 방출한다. 이러한 특성을 갖는 염료를 조합으로써 합성된 RPS-1은 살아있는 세포내 다양한 구획의 극성을 정량적으로 보여주었으며 나아가 리소좀 극성이 다양한 유형의 세포에서 가장 높다는 것을 밝혀냈다. | - |
| dc.description.tableofcontents | CHAPTER 1 1 1.1 INTRODUCTION FOR FLUORESCENCE PROBES 1 1.1.1 Fluorescent Microscopy-based Imaging Techniques 1 1.1.2 Design of Fluorescence Probes for Bio-applications 2 1.1.3 Sensing Mechanisms of Fluorescence Probes 3 1.1.4 Developed Fluorescence Probes for Bio-imaging 4 CHAPTER 2 6 2.1 A TWO-PHOTON RATIOMETRIC FLUORESCENCE PROBE FOR CARBOXYLESTERASE ACTIVITY IN HEPATOCYTE 7 2.1.1 INTRODUCTION 7 2.1.2 RESULT AND DISCUSSION 8 2.1.2.1 Design Strategy of SE1 8 2.1.2.2 Measurement of Photophysical Properties for SE1 9 2.1.2.3 Enzymatic Reaction Analysis of SE1 11 2.1.2.4 TPM Ratiometric Imaging Studies for SE1 in Liver 17 2.1.3 CONCLUSION 23 2.1.4 EXPERIMENTAL SECTION 24 2.2 A CARBOXYLESTERASE-2 SELECTIVE TWO-PHOTON RATIOMETRIC PROBES IN BREAST CELL 26 2.2.1 INTRODUCTION 26 2.2.2 RESULT AND DISCUSSION 27 2.2.2.1 Design Strategy of Probe1 and Probe2 27 2.2.2.2 Measurement of Photophysical Properties for Probe1 and Probe2 28 2.2.2.3 Enzymatic Reaction Analysis of Probe1 and Probe2 30 2.2.2.4 TPM Ratiometric Imaging Studies for Probe1 and Probe2 35 2.2.3 CONCLUSION 42 2.2.4 EXPERIMENTAL SECTION 43 CHAPTER 3 48 3.1 COMBINING HYDROPHOBIC AND HYDROPHILIC SENSORS FOR DETECTION OF CELLULAR POLARITY DISTRIBUTION 49 3.1.1 INTRODUCTION 49 3.1.1.1 Importance for Detection of Intracellular Polarity 49 3.1.1.2 Limitation of Currently Developed Polarity Probes 50 3.1.2 RESULTS AND DISCUSSION 51 3.1.2.1 Design Strategy of RPS-1 51 3.1.2.2 Measurement of Photophysical Properties for Dye1 and Dye2 52 3.1.2.3 Fluorescence Imaging Studies of Dye1 and Dye2 in HeLa Cells 57 3.1.2.4 Measurement of Photophysical Properties for Dye3 and RPS-1 59 3.1.2.5 Ratiometric Imaging Analysis of RPS-1 for Polarity Distribution 64 3.1.3 CONCLUSION 68 3.1.4 EXPERIMENTAL SECTION 69 REFERENCES 75 | - |
| dc.language.iso | eng | - |
| dc.publisher | The Graduate School, Ajou University | - |
| dc.rights | 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다. | - |
| dc.title | Ratiometric Two-photon Fluorescence Probes for Carboxylesterase Activity and Cellular Polarity | - |
| dc.title.alternative | PARK SANG JUN | - |
| dc.type | Thesis | - |
| dc.contributor.affiliation | 아주대학교 일반대학원 | - |
| dc.contributor.alternativeName | PARK SANG JUN | - |
| dc.contributor.department | 일반대학원 에너지시스템학과 | - |
| dc.date.awarded | 2020. 8 | - |
| dc.description.degree | Doctoral | - |
| dc.identifier.localId | 1151648 | - |
| dc.identifier.uci | I804:41038-000000030110 | - |
| dc.identifier.url | http://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/common/orgView/000000030110 | - |
| dc.subject.keyword | Carboxylesterase | - |
| dc.subject.keyword | Polarity | - |
| dc.subject.keyword | Quantitative analysis | - |
| dc.subject.keyword | Ratiometric probe | - |
| dc.subject.keyword | Two-photon fluorescence | - |
| dc.description.alternativeAbstract | Fluorescent microscopy-based imaging method became an essential technique for living system imaging because of its high-resolution and sensitivity, low-cost, and noninvasive real-time capabilities. Since the advent of confocal and two-photon microscopy, many significant technological improvements have gone beyond the limits of optical microscopy, solving complex cellular processes in pathological or normal biological systems from cells to small animals. However, despite the remarkable development of fluorescent imaging technology, appropriate fluorescence probes for quantitative detection are still limited. This thesis introduces the development of ratiometric fluorescence probes for quantitative detection, and the results of probes for detecting variation in enzyme activity and polarity in biological system. Carboxylesterases (CEs) are carboxylesterase family that catalyze hydrolysis of numerous exogenous and endogenous substrates. Among them, carboxylesterase-1 (CE1) and carboxylesterase-2 (CE2) are two representative isozymes in human, and these enzymes are heterogeneously distributed in throughout the body. Disorder or deficiency of CE1 led to liver disease and lipid metabolism disorder, and abnormal CE2 activity in the body is known to be closely related to the expression of various cancer types. In addition, these enzymes are also involved in pharmacological action such as anticancer drugs. Thus, the development of fluorescence probe that can quantitatively detect CE1 and CE2 activity in living samples might be a useful method for analyzing pharmacological actions as well as diagnosis of various diseases. Herein, we developed a CEs sensitive ratiometric probe (SE1), which showed blue to yellow fluorescence color change according to the enzymatic hydrolysis. This probe showed similar reaction kinetics to a commercialized probe (FDA), but SE1 was even more stable to biological components, allowing long-term detection of enzyme activity in living samples. Furthermore, we developed CE2 selective ratiometric probes (Probe1 and Probe2) by improving the hydrolysis site of SE1 as a follow-up study. In particular, Probe2 had high photostability under imaging conditions and was used to observe CE2 activity in breast cells that have not been reported, as well as in colorectal cancer cells, and Probe2 reveled the CE2 activity in breast cancer cells was significantly low. Intracellular polarity plays an important role to various cellular processes, including immune system regulation, cell proliferation, and vectorial transport of molecules. Intracellular organelles have the optimal polarity in real-time according to their role and environment change in the cell, and the abnormal polarity directly cause neurological diseases, diabetes, and cancer. Therefore, it is important to detect cellular polarity in studies of biological and pathological phenomena. Here, we developed a wide range of polarity observable ratiometric probe (RPS-1), which combined 'turn-on' probe (Dye1) and 'turn-off' probe (Dye3) as the environmental polarity increase. Dye1 and Dye3 have similair absorption wavelengths, but since the Stokes shifts are different, Dye1 and Dye3 have emission colors of the yellow and red regions, respectively. RPS-1, developed as a combination of dyes with these characteristics, quantitatively showed the polarity of different compartments in living cells, and proved the lysosomal polarity was the highest in the all type of cells. | - |
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- Graduate School of Ajou University > Department of Energy Systems > 4. Theses(Ph.D)
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