미토콘드리아 기능손상으로 생성된 활성산소가 claudin-1의 발현에 미치는 영향 연구.

Abstract

미토콘드리아는 세포가 필요로 하는 에너지 생성을 관장하는 세포 내 소기관이다. 정상세포는 산소가 존재하는 환경에서는 미토콘드리아의 산화적 인산화 과정을 통해 에너지를 생성하고, 산소가 존재하지 않는 경우 해당과정만을 이용해 에너지를 생성한다. 그러나 많은 암세포의 경우, 미토콘드리아의 ATP 생성능력이 저하되어 있는 것이 관찰되어 있고, 산소의 존재 유무와 상관없이 해당과정에 의존적으로 ATP를 합성한다. 이와 같이 암세포에서 관찰되는 미토콘드리아 기능의 저하가 어떠한 기전에 의해 나타나며, 암세포의 증식능력과 전이활성 (invasion)에 어떻게 연관되어 있는지에 대한 연구는 미흡한 실정이다. 이전보고에서 간암에서 미토콘드리아 기능손상이 밀착연접 단백질의 하나인 Claudin-1 (Cln-1)의 발현을 통해 암세포의 전이활성을 증가시킨다는 사실을 보고하였고, 이를 통해 본 연구에서는 미토콘드리아 호흡기능 손상이 어떤 분자기전에 의해 Cln-1의 발현을 조절시키는지 규명하고자 하였다. 미토콘드리아 호흡기능 손상 유도 모델로 미토콘드리아 전자전달계 복합체Ⅰ의 저해제인 rotenone을 정상 간세포주인 Chang세포에 처리하였다. Cln-1의 mRNA와 단백질 발현의 증가가 rotenone에 의해 유도된 것을 확인하여, 전사수준에서 Cln-1의 발현이 증가됨을 알 수 있었다. 같은 조건에서 미토콘드리아성 활성산소가 증가되어 있는 것을 활성산소에 의한 Cln-1발현을 조절하는 것을 확인하였다. 또한rotenone에 의해 증가된 Cln-1의 발현이 항산화제인 N-acetylcysteine의 전 처리에 의해 소실되는 것으로 보아, rotenone에 의한 미토콘드리아 손상으로 유도되는 Cln-1 발현증가는 미토콘드리아에서 생성되는 활성산소에 의해 매개되는 것임을 알 수 있었다. 이러한 활성산소에 의해 어떠한 전사조절기전에 의해 Cln-1의 발현이 조절되는 지를 규명하기 위해, Cln-1의 -2700bp에서 +300bp promoter 유전자 서열을 TFSEARCH program을 이용하여 분석한 결과 Heat Shock Factor1 (HSF1) 전사인자의 결합부위가 여러 부분 존재하는 것을 확인하였다. 이를 확인하고자 Chang세포주에서 rotenone에 의해 HSF1의 band shift가 증가하는 것을 확인하였고, 해당 band가 phosphorylation에 의해서 activation 된 band인지 확인하기 위해 lambda phosphatase처리와 S326 잔기에 인산화된 HSF1 항체로 shift된 band가 HSF1의 phosphorylation에 의해서 activation 된 band임을 확인 하였다. 그리고 NAC 처리로 band의 shift가 복구되는 것으로 보아 활성산소에 의해 HSF1의 activitiy가 조절됨을 알 수 있었다. HSF1의 활성화에 의해서 Cln-1이 조절됨을 확인하고자 HSF1을 Knockdown과 Overexpression에 의해 Cln-1 발현이 조절됨을 알 수 있었다. 또한Cln-1의 promoter를 이용한 chip assay와 luciferase assay를 통해 ROS와 rotenone에 의해 HSF1의 binding activity가 조절됨을 확인하여, 이로서 미토콘드리아의 호흡기능 억제에 의한 Cln-1 발현 증가가 활성산소를 매개로 한 HSF에 activation에 의해 조절된 것임을 알 수 있었다. 미토콘드리아의 기능손상이 저하되어 있고, Cln-1과 HSF1의 발현이 증가해 있는 간암세포주인 SNU 449에서 HSF1의 Knockdown에 의해 Cln-1의 발현이 저하되는 것과 동시에 침투활성이 감소하는 것을 확인하였다. 본 연구를 통해 암세포의 미토콘드리아 기능손상에 의한 활성산소의 증가로 HSF1의 활성화가 유도되고, Cln-1의 발현이 증가 함으로서 암세포의 침투활성이 증가됨을 알 수 있었다. 이 결과로 미토콘드리아 기능손상이 간암의 악성화에 기여하는 분자기전을 좀 더 구체적으로 이해할 수 있었다. 본 연구로 미토콘드리아 기능 손상을 가지고 있는 간암치료에 대한 새로운 제어타겟을 제시하게 될 것으로 기대한다.