땅콩 알레르기 생쥐 모델에서 면역치료를 위한 적절한 면역원으로서 감마선 조사된 땅콩 단백의 평가

Abstract

연구배경 및 목적 : 연구자들은 최근 난백에 감마선을 조사함으로 난백 알레르겐의 IgE 결합 epitope 의 구조를 변화시킴으로써 결국 난백의 알레르기 항원성을 감소시켜 난알부민 (ovalbumine, OVA) 을 이용한 난백 알레르기 환자를 대상으로 한 피부단자시험 (skin prick test) 에서 즉시형 피부반응의 격감효과를 증명한 바 있다. 이에 연구자들은 감마선 조사 기술을 땅콩 알레르기에도 적용하여 감마선 조사한 땅콩 단백과 조사하지 않은 땅콩 단백을 땅콩 환자혈청 및 기존에 확립한 땅콩 알레르기 생쥐 모델을 이용하여 감마선 조사 기술이 새로운 면역원 제조에 이용될 수 있는지를 평가하고자 하였다. 재료 및 방법 : 1) 땅콩에서 추출한 땅콩 단백에 각각 5, 10, 20, 50 kGy의 감마선을 조사한 후 감마선 조사하지 않은 순수 땅콩 단백과 함께 SDS-PAGE를 수행하여 단백 분획의 차이를 보았으며, 땅콩 알레르기 환자혈청을 이용하여 IgE immunoblot, ELISA, inhibition ELISA을 시행하여 순수 땅콩 단백과 감마선 조사된 땅콩 단백들에서의 땅콩 특이 IgE의 결합능을 비교 분석하여 항원성을 평가하였다. 또한, competitive indirect ELISA (Ci-ELISA)을 시행하여 감마선 조사된 땅콩 단백의 IgE, IgG 결합능을 순수 땅콩 단백과 정량으로 비교 분석하여 항원성을 평가하였다. 2) 4 주령의 암컷 C3H/HeJ 생쥐 10 마리를 각각 5마리씩 두 그룹으로 나눈 후 G1 (n=5)은 0 kGy 감마선 조사하지 않은 땅콩 단백을 항원보조제인 cholera toxin과 함께 각각 한 마리당 1 mg 씩 d0, 1, 2, 7에 위장 투여하여 감작시킨 후 d21에 challenge하였다. 이 때 G2 (n=5) 는 음성대조군으로 사용하였다. 감작 후 제 5 주에 생쥐를 희생하여 얻은 비장세포배양액으로부터 0 kGy 감마선 조사하지 않은 땅콩 단백, 10 kGy 감마선 조사한 땅콩 단백, 50 kGy 감마선 조사한 땅콩 단백으로 자극한 후 T 세포 증식분석과 사이토카인을 측정하여 감마선 조사된 땅콩 단백의 항원성을 비교 평가하였다. 3) 4 주령의 암컷 C3H/HeJ 생쥐 20마리를 각각 5마리씩 네 그룹으로 나눈 후 G1 (n=5)은 0 kGy 감마선 조사하지 않은 땅콩 단백을, G2 (n=5) 는 10 kGy 감마선 조사한 땅콩 단백을, G3 (n=5) 은 50 kGy 감마선 조사한 땅콩 단백을 항원보조제인 cholera toxin과 함께 각각 한 마리당 1 mg 씩 d0, 1, 2, 7에 위장 투여하여 감작시킨 후 d21에 challenge하였다. 이 때 G4 (n=5) 는 음성대조군으로 사용하였다. 감작시키는 동안 매주 생쥐의 미정맥으로부터 혈청을 분리하여 땅콩 특이 IgE, IgG1, IgG2a 를 측정하였으며 감작 후 제 5 주에 생쥐를 희생하여 얻은 비장세포배양액으로부터 T 세포 증식분석과 사이토카인을 분석하여 감마선 조사된 땅콩 단백의 항원성을 평가하였다. 결과 : 1) SDS-PAGE에서는 감마선 조사선량이 증가할수록 땅콩 단백 분획이 감소됨을 관찰할 수 있었으며, 땅콩 알레르기 환자의 혈청을 이용한 IgE immunoblot, ELISA, inhibition ELISA 실험에서 모두 감마선 조사선량이 증가할수록 땅콩 환자 혈청 내 땅콩 특이 IgE 의 결합능이 감소됨을 알 수 있었다. 또한 Ci-ELISA를 통해 감마선 조사로 인해 땅콩 단백의 구조가 변하였음을 관찰 할 수 있었다. 2) 땅콩 알레르기가 유발된 생쥐의 비장세포에 각각 0 kGy 감마선 조사하지 않은 땅콩 단백, 10 kGy 감마선 조사한 땅콩 단백, 50 kGy 감마선 조사한 땅콩 단백으로 자극하였을 경우, 감마선 조사한 땅콩 단백들 (10 kGy, 50 kGy)이 순수 땅콩 단백 (0 kGy) 의 자극보다 IL-10의 증가 및 Th1 / Th2 의 ratio 가 증가함을 알 수 있었다. 3) 생쥐에 순수 땅콩 단백 (0 kGy) 및 감마선 조사한 땅콩 단백 (10 kGy, 50 kGy) 을 위장 투여한 실험의 경우에서는 50 kGy 감마선 조사한 땅콩 단백을 위장 투여한 G3 에서 땅콩 특이 IgE가 감소함을 관찰할 수 있었으며, 땅콩 특이 IgG1과 IgG2a는 감마선 조사한 모든 그룹 (G2, 3) 에서 모두 감소하였다. 사이토카인의 경우 감마선 조사한 그룹 (G2, G3)에서 G1에 비해 IL-10의 증가와 더불어 Th1 / Th2의 ratio 가 증가함을 관찰할 수 있었다. 결론 : 감마선 조사선량이 증가함에 따라 땅콩 항원 이차구조에 변화가 일어났으며, 이로 인해 땅콩 알레르기 환자혈청 내 땅콩 특이 IgE 와의 반응성은 감소되었다. 또한 땅콩 알레르기를 유발한 생쥐의 비장세포 자극 모델에서는 감마선 조사된 땅콩단백의 자극이 순수 땅콩 단백에 비해 IL-10의 증가 및 Th 1 / Th 2 ratio 증가를 관찰되었다. 또한 감마선 조사된 땅콩 단백을 생쥐에 직접 위장 투여한 한 실험에서도 땅콩 특이 IgE의 감소와 더불어 IL-10의 증가와 함께 Th1 / Th 2 ratio가 증가함으로써 면역치료에 사용할 수 있는 새로운 면역원으로서의 긍정적인 평가를 할 수 있었다.