폐상피세포 A549에서 류코트리엔 제 1 수용체를 통한 케모카인의 발현에 미치는 류코트리엔 D4 의 영향

Abstract

연구배경 및 목적 : 류코트리엔 C4, D4 그리고 E4 (Leukotriene C4, D4, E4) 와 같은 시스테인 류코트리엔 (cysLTs)은 지질 전염증 매개인자 (proinflammatory lipid mediator)로서, 세포막의 아라키돈산 (arachidonic acid)으로부터 5-리폭시제나아제 (5-lipoxygenase) 경로를 통해 생성된다. 이들은 기관지수축, 점액질 분비, 기도과민성, 혈관 과투과성 등을 야기하는 중요한 물질로 알려져 있고, 생체내에서 염증 반응을 개시하는 백혈구를 직,간접적으로 유인하는 역할을 하는데, 이는 G-단백결합수용체인 류코트리엔 제 1 수용체 (CysLTR1)를 통해 신호를 전달하는 것으로 알려져 있다. 폐의 상피세포 (Human lung epithelial cells) 인 A549에 IL-4나 IL-13을 자극함에 따라 CCL24, CCL26과 같은 케모카인 (chemokine) 의 생성을 조절할 수 있다는 보고는 있었으나, 류코트리엔과의 관계에 대한 보고는 아직 없었다. 이 실험의 목적은 폐 상피 세포인 A549에서 LTD4의 자극에 의해 조절되는케모카인을 찾아보고, 그 물질들이 유도되는 것이 LTD4의 수용체인 CysLTR1을 매개로 하는지를 연구하여, 천식과의 관련성을 규명하는 것이다. 연구방법 : 류코트리엔 D4의 자극에 의해 시간에 따라 CysLTR1의 발현량에 차이를 보이는 세포주를 선정하기 위해 real-time RT-PCR 를 실시하였고, 그 결과 폐 상피 세포인 A549가 선정되었다. 0, 2, 4, 6 시간동안 LTD4에 의해 자극받은 A549세포에서 추출한 RNA 로부터 cDNA 를 얻어, 84가지의 염증관련 사이토카인/케모카인의 프라이머(primer)가 장착되어 있는 사이토카인 array를 가지고 real-time RT-PCR를 실시함으로써, LTD4에 의해 특정 시간에 유도되는 사이토카인을 선별하였다. 이 과정을 통해 선정된 CCL2 (MCP-1) 와 CXCL10 (IP-10) 의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 제작, real-time PCR에 이용하였다. 먼저, A549에서 두 케모카인에 미치는 LTD4의 영향을 보기 위해 LTD4를 시간별로 처리한 A549 세포를 준비하였다. 그리고 CysLTR1이 과발현된 상태를 만들기 위해 pCMV vector 에 CysLTR1의 아미노산을 암호화 하는 부위(Coding region)을 재조합한 pCMV-CysLTR1 CDS 플라스미드를 A549 에 형질전환(transfection) 한다. 이 후 마찬가지로 시간별로 LTD4를 처리하여 CysLTR1이 과발현된 상태에서 MCP-1과 IP-10에 미치는 LTD4 의 영향을 보고자 했다. LTD4에 의해 유도되는 MCP-1과 IP-10이 실제 LTD4의 수용체인 CysLTR1을 매개로 하는 것인지를 알아보기 위해 CysLTR1의 길항제(antagonist)인 MK-571을 처리하고, LTD4를 처리해 보았다. 이렇게 각각 다른 상황에서 MCP-1과 IP-10의 mRNA와 분비되는 단백질이 어떻게 발현되는지 관찰하기 위해, mRNA의 경우 real-time RT-PCR을, 단백질의 경우 ELISA를 실시하였다. 또한, 형질전환된 CysLTR1유전자가 mRNA 로 전사되는지 RT-PCR로 알아보았고, 단백질로 만들어지고, 수용체로서의 역할을 할 수 있도록 세포막으로까지 이동되는지 알아보기 위해 유세포 측정법 (flow cytometry) 을 이용하였다. 결과 : A549에 LTD4 100nM 을 처리하고 30분 만에 MCP-1 mRNA 의 발현이 증가되었고, IP-10의 경우 MCP-1 과 비교할 때 증가된 정도의 차이는 미비하나, 역시 LTD4 처리 1시간 후에 mRNA의 발현이 증가됨이 관찰되었다. A549에 CysLTR1을 형질전환 후 MCP-1과 IP-10의 mRNA 발현량을 측정한 결과, 두 케모카인 모두 각각 500 배, 300 배 정도씩 눈에 띄게 증가하였다. CysLTR1을 과발현시키고 LTD4 100nM를 처리했을 때와 단순히 LTD4만 자극했을 때의 A549에서 두 케모카인의 발현양을 비교했을 때, 각각 비슷한 경향으로 발현되는 것을 볼 수 있었다. 그러나 세포 밖으로 분비되는 단백질을 ELISA 방법으로 측정한 결과, MCP-1의 단백질의 농도는 CysLTR1을 과발현 시킨 이후에 오히려 감소된 것을 볼 수 있었고, CysLTR1이 과발현된 A549에 LTD4를 처리한 이후에 차츰 그 양이 증가되었다. IP-10의 경우에는 mRNA 의 발현양상과 비슷하게, CysLTR1이 과발현 된 상태에서 단백질의 분비량도 100배 가량 증가되었고, mRNA의 발현에 있어서 LTD4의 영향이 미비했던 것과 달리 LTD4 처리 후 단백질 분비량은 확연히 증가되는 것이 관찰되었다. 이러한 반응들이 실제 CysLTR1을 매개로 하는 것인지 알아보기 위해 MK-571을 처리해 보았다. CysLTR1을 과발현 시킨 A549 세포에 MK-571을 처리하고 MCP-1 과 IP-10의 mRNA 발현양을 측정한 결과, MCP-1은 MK-571 전과 후에 아무런 변화가 없었고, IP-10의 경우 MK-571을 처리하자 그 양이 현저히 감소되었다. 이후 LTD4를 처리했을 때 MCP-1은 종전의 발현 양상과 다름없이 발현되었지만, MK-571에 의해 현저히 감소되어 아무것도 처리하지 않은 A549 에서의 발현량 정도였던 IP-10의 경우, LTD4에 의해 완전히 회복되고, 또한 더욱 증가되는 것을 볼 수 있었다. 이로써, IP-10은 직접적으로 CysLTR1을 매개로 신호가 전달되고, 발현이 조절됨을 알 수 있고, MCP-1은 CysLTR1의 영향을 받긴 하지만 간접적으로 신호가 전달되는 케모카인인 것이 밝혀졌다. 형질전환된 CysLTR1유전자가 실제 세포막으로 이동하여 수용체로서의 역할을 담당할 수 있는지를 알아보기 위해 유세포 측정법으로 세포 표면의 수용체의 개수한 결과, 일반 A549의 세포막에 존재하는 수용체보다 약 7배 가량 많은 수용체가 CysLTR1 유전자를 형질전환 시킨 A549의 세포막에서 측정되었다. 이로써 과발현시킨 CysLTR1 유전자가 mRNA로 전사되는 수준에서 끝나는 것이 아니라 단백질로도 표현되고, 실제로 사용될 수 있음이 밝혀졌다. 결론 : CCL2 (MCP-1)과 CXCL10 (IP-10)은 류코트리엔 D4 (LTD4)에 의해 mRNA 발현량이 증가되고, 류코트리엔 제 1 수용체 (CysLTR1)가 과발현된 조건 하에서 아무런 자극 없이도 발현량이 급격히 증가된다. 그러나 IP-10은 직접적으로, 반면 MCP-1은 간접적으로 CysLTR1의 영향을 받아 발현이 조절된다.