Expression and Functional Analysis of Hepatitis B Virus DNA Polymerase

Alternative Title
B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 발현 및 기능분석
Alternative Author(s)
Park, Gil Soon
Kim, Kyongmin
일반대학원 의학과
The Graduate School, Ajou University
Publication Year
Hepatitis B Virus DNA polymeraseChimerareplicationcore particle formationsplicingpolymerase-surface (PS) fusion proteinreplication중합효소-표면 fusion RNA복제세포골격Polyclonal 항체Chimeric DNA 중합효소
목적 목적: B형 간염 바이러스는 세계적으로 주요한 pathogen중 하나로 그들의 복제기전과 구성물의 정확한 생물학적 역할을 이해하는 것은 중요하다. Chimeric DNA 중합효소를 이용하여 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 어느 부위가 복제에 중요한지를 알아보고자 하였다. 재료 및 방법 방법: 사람 B형 간염 바이러스와 오리 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 아미노산 서열을 alignment하여 상호적으로 교체할 부위를 결정하여 inframe으로 사람 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소에 상응하는 오리 B형 간염 바이러스 부위를 cloning 하였다. 부위별 기능 분석을 위해 사람 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 각 domain을 박테리아에서 발현시켜 토끼에 주사하여 polyclonal 항체를 얻었다. 우선 얻은 항체로 wt 사람 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 세포네 발현과 위치를 immunofluoresence assay를 이용하여 알아보았다. Chimeric DNA 중합효소가 B형 간염 바이러스의 복제와 encapsidation을 재개 할 수 있는지 endogenous polymerase assay와 encapsidation assay를 수행 했으며 chimeric DNA 중합효소 RNA와 단백질의 발현은 Northern blot analysis와 immunofluoresence assay를 통해 알아 보았다. 또한 chimeric DNA 중합효소의 발현이 B형 간염 바이러스 core particle 형성에 미치는 영향을 알아보기 위해 core particle western blot analysis를 시행하였다. 결과 결과: B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 TP (terminal protein) 부위에 특이적인 항체를 얻었으며 이 항체를 이용하여 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소의 세포네 위치가 cytoplasm 전반에 걸쳐서 존재 하였으며 endoplasmic reticulum, Golgi 그리고 peroxisome에 분포하지 않음을 알 수 있었고 복제를 수행하고 있는 세포에서도 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소와 B형 간염 바이러스의 spliced 단백질을 확인 할 수 있었다. 그러나 chimeric DNA 중합효소 construct는 단백질로서 발현하지 않아 B형 간염 바이러스 복제와 encapsidation이 일어나지 않았다. Chimeric DNA 중합효소 RNA는 core particle 형성에 영향을 주는 것으로 확인 되었다. 결론 결론: 이 연구에서 제작된 TP 특이적 항체는 B형 간염 바이러스 DNA 중합효소 연구에 폭 넓게 이용될 수 있음을 보여 주었고 비록 chimeric DNA 중합효소가 B형 간염 바이러스 복제나 encapsidation을 재개 할 수는 없었지만 chimeric DNA 중합효소 RNA의 primary sequence가 B형 간염 바이러스 생활사중 core particle의 형성에 영향을 미치는 결과는 이 바이러스 genome의 선천적 복합성을 시사하고 이 부분에 대한 앞으로의 연구가 필요하다는 것을 알 수 있었다.
Alternative Abstract
PART Ⅱ Down-regulation of hepatitis B virus replication by splicing event Various spliced HBV transcripts have been described in human liver tissues and in HBV-transfected hepatoma cell lines, but their functions are unknown. To analyze the expression and the function of HBV DNA polymerase, HBV DNA polymerase construct was tranfected into hepatoma cells and then several spliced HBV RNAs from expressed HBV DNA polymerase RNA were founded. Since the spliced RNA encoded new viral protein, the polymerase-surface (PS) fusion protein was analyzed in detail. By confocal microscopy with monoclonal antibody specific for surface antigen and polyclonal antiserum specific for TP domain of HBV DNA polymerase, the exclusive expression of PS fusion protein in perinuclear region was detected. Also, intracellular distribution of PS fusion protein was overlapped with nuclear pore complex and vimentin, which is known as intermediate filament providing a perinuclear stable core area, as well as endoplasmic reticulum. Also, HBV small antigen secretion was drastically inhibited even with a small amount of this construct. Since it is possible that PS fusion protein expression might be involved in HBV life cycle by modulating gene regulation through nuclear/cytoplasmic transport like Rev protein of HIV, the spliced RNA only expressing mutant that did not express PS protein to elucidate the modulatory effects of the spliced RNA or the PS fusion protein on HBV life cycle. Core particle formation was blocked by the expression of spliced construct. Also, when the PS fusion RNA expression was increased, HBV DNA synthesis was decreased gradually by endogenous polymerase assay and Southern blot analysis. These data indicate that PS fusion RNA down-regulates HBV DNA synthesis, which distinguishes the HBV large surface RNA with PS fusion RNA. Taken together, these data suggest that PS fusion RNA may modulate the HBV replication, which is different from the reported previously.

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Graduate School of Ajou University > Department of Medicine > 3. Theses(Master)
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