새로운 벡터 시스템을 이용한 lox site간 Cre-매개 재조합 효율 측정

Abstract

목적 : 새로운 벡터 시스템을 이용하여 lox site 사이의 Cre-매개 재조합 효율을 측정하고자 하였다. 재료 및 방법 : 두 lox site 사이의 cre-매개 재조합 효율을 분석하기 위하여 새로운 벡터 (pFGB)를 제작하였다. lox wt, M2, M3, M7, M11, lox 2272 및 lox 5171을 사용하여 wild type과 mutant lox site의 조합을 새로운 백터인 pFGB에 클로닝 41개의 pFGB-lox/lox를 얻었다. Cre를 발현하는 BS1365 박테리아 내로 이 plasmid들을 형질전환 하고 37℃에서 하룻밤 배양한 후, BS1365로부터 plasmid DNA를 분리하였다. 분리된 DNA를 JM109 박테리아에 형질전환 하고 ampicillin, X-gal, IPTG를 포함하는 LB agar plate에 펴 발라 배양하였다. 전체 콜로니와 청색 콜로니의 수를 셈으로써 재조합 효율을 구하였다. 결과 : pFGB 벡터 내로 lox wt, lox 2272, lox 5171, M2, M3, M7, M11을 클로닝 하여 41개의 pFGB-lox/lox를 얻었다. Cre를 발현하는 박테리아 BS1365를 이용하여 재조합을 유도한 결과 lox wt은 lox 2272, lox 5171, M3, M7과 0.1% 이하의 재조합 효율을 보였으며 M2/M2, M7/M7, 2272/2272, 5171/5171의 동일한 sequence 사이에서의 재조합 효율은 약 99%, M3/M3는 약 46%의 재조합 효율을 나타냈다. 서로 다른 sequence의 lox site들 사이의 재조합에 있어서는 lox wt, lox 2272, lox 5171과 lox wt, M3, M7 및 lox 5171의 두 그룹이 같은 그룹에 속하는 lox sites 간에 1% 이하의 재조합 효율을 보였다. 결론 : 새로운 벡터 (pFGB)를 제작하였고 이 벡터와 BS1365 박테리아를 이용하여 다양한 lox site들 사이의 cre-매개 재조합 효율을 측정하였다. 재조합 효율이 1% 이하인 incompatible한 lox site들로는 lox wt, lox 2272, lox 5171과 lox wt, lox 5171, M3, M7이 있었다. 이 incompatible한 lox site들을 이용하여 특정 유전자의 염색체내 통합, 유전자 교체 및 결실과 같은 유전자 조작에 적용하는 연구가 진행되어야 할 것이다.