Regulatory Mechanisms of Mitotic Catastrophe Induced by Doxorubicin

Abstract

Doxorubicin을 50 ng/ml 농도로 human hepatoma cell line 인 Huh-7 cells에 처리를 하면 시간이 지남에 따라 세포 크기가 커지고 납작해지면서 senescence associated β-galactosidase (SA-β-gal)의 활성이 증가하는 노화유사 표현형 (senescence-like plenotype; SLP)이 관찰되었다. 이러한 SLP 가 유도되는 동안 doxorubicin이 3일간 처리된 Huh-7 세포의 약 30% 에서 multipolar spindle 구조가 관찰되었고 이러한 multipolar spindle 구조에 의한 abnormal mitosis 일어남으로서 여러 개의 핵 (multiple nuclei) 이나 아주 작은 핵 (micronuclei) 들을 가진 세포들이 시간에 따라 크게 증가하였다 (mitotic catastrophe). 6일 정도에 SLP가 최고에 도달한 이후 세포의 생존도는 서서히 apoptosis가 아닌 mitotic catastrophe 가 원인이 되는 세포사에 의해 감소하기 시작하여 doxorubicin 처리 9일째에 50% 정도의 세포사가 관찰되었다. Mitotic catastrophe에 의한 cell death 시에는 세포막을 구성하는 phosphatidyl serine의 위치변화 및 mitochondria로부터 cytochrome c 가 세포질로 방출되는 현상이 apoptosis 시와 공통되게 관찰되었으나, stress activated MAPK (p38, JNK) 및 caspases 들의 활성화가 apoptosis와 다르게 거의 나타나지 않았으며, 또한, 핵막의 integrity가 소실됨이 관찰 되었는데 이러한 결과들은 Huh-7 세포에서 관찰되는 mitotic catastrophe에 의한 cell death는 apoptosis와는 전혀 다른 necrosis와 유사한 세포사멸 기전임을 확인하였다. 이러한 LD doxorubicin에 의한 cell death의 원인인 mitotic catastrophe (혹은, mutinucleation)의 조절 기전을 이해하기 위하여, p21 유전자를 가지고 있거나 (P21+/+) 혹은 가지고 있지 않은 (P21-/-) human colorectal carcinoma cell line인 HCT116 세포에 doxorubicin을 처리한 후 multinucleation 정도를 비교하였다. p21을 발현할 수 있는 세포에서는 (p21+/+ cells) multinucleation 이 유도되지 않는 반면에, p21이 없는 세포 (p21-/- cells) 에서는 multinucleation이 관찰되었다. 또한, 50 nM의 doxorubicin이 처리된 p21+/+ 세포는 G₁cell cycle에 세포들이 arrest 되는 반면 p21-/- 세포들에서는 특정 cell cycle에 arrest 되지 않으면서 Cdc2 및 Cdk2 활성이 그대로 유지되었다. Cdc2 와 Cdk2 활성 억제제인 roscovitine 이나 purvalanol A를 p21-/- 세포에 처리하는 경우, multinucleation 생성을 감소시킬 수 있었는데, 이러한 사실은 p21-/- 세포에서 Cdc2 와 Cdk2의 활성 유지가 multinucleation 생성에 매우 중요하게 작용함을 시사한다. 그러나 500 nM의 doxorubicin을 처리하면 p21의 유무에 상관없이 ATM/Chk signaling pathway가 활성화 됨으로서 G₂cell cycle arrest 가 유도되고 multinucleation은 생성되지 않았다. 그러나, ATM/Chk signaling pathway의 활성을 억제할 수 있는 caffeine을 함께 처리하면 p21+/+ 세포는 G₂phase arrest 가 풀린 후 G₁phase에서 다시 arrest가 되면서 multinucleation은 유도되지 않았다. p21-/- 세포에서는 G₁cell cycle arrest 가 관찰되지 않았고 multinucleation 생성은 caffeine 농도에 의존적으로 크게 증가하였다. 결론적으로 doxorubicin은 abnormal mitosis가 원인이 되어 multinucleation 을 유도하는데, 이러한 multinucleation의 유도를 위해서는 Cdc2 및 Cdk2 활성이 요구되며, 또한, DNA damage 후 특정 cell cycle arrest (G₁or G₂)가 일어나지 않는 조건을 필요로 한다는 사실을 확인하였다. 따라서 p21은 LD doxorubicin 에 노출된 세포에서 Cdc2 및 Cdk2 의 활성을 억제함으로서 multinucleation 생성을 막는데 반드시 필요하지만, MD doxorubicin은 p21의 존재유무에 상관 없이 G₂arrest를 유도시킴으로서 multinucleation 생성을 억제하지만 이러한 G₂arrest를 극복하는 세포에서는 p21이 G₂arrest 이외에 부가적으로 작용하여 이 세포들을 다시 G₁phase 에 arrest 를 시킴으로서 multinucleation 생성을 억제할 수 있다.