비침습적 형광이미징 방법을 이용한 돼지 연골 유래 세포외기질 지지체의 생체 내 분해 프로파일

Abstract

3차원 지지체가 분해되는 속도 및 능력은 새로운 조직 설계에 매우 중요한 인자이며, 이러한 지지체는 조직이 재생될 때까지 기계적 성질을 제공해주어야 하고, 조직의 재생이 끝나면서 안정적인 속도로 분해가 이루어 져야한다. 기존에 알려진 분해도 측정 기술들은 시료를 손상시켜야 하고, 또한 체내에서의 분해도 측정에는 시료를 채취해서 분해 값을 도출하기 때문에 연속적인 값이라고 할 수 없어서 정확한 분해도를 확인하는데 어려움이 있다. 본 연구의 목적은 재료에 형광결합을 함으로써 비침습적인 방법으로 실시간 분해정도를 시각화 하고, 그것들을 정량화 하여 최종 분해 개요를 얻고자 한다. 돼지 연골 유래 세포 외 기질 분말(Porcine cartilage derived extracellular matrix powder, PCP)을 이용하여 3차원 다공성 지지체를 제작하였고, 그 자체의 분해도를 측정하기 위해Cy3-NHS ester의 농도를 확인한 후 지지체에 Cy3 NHS ester를 결합하였다. PCP 지지체에 Cy3를 결합한 후 PBS로 미결합된 Cy3를 제거했다. 제작된 Cy3-PCP 지지체는 절편을 내어 고르게 결합되었는지 형광현미경을 통해 확인하고, 1차아민 정량법을 이용하여 정량화 하였다. 또한 Cy3용액을 배양하여 형광강도의 자연적 감소 여부를 확인하였다. 체내실험에 들어가기 앞서 미세단층촬영기(μCT)를 이용하여 지지체의 초기 부피를 측정한 후 형광결합을 하여 누드마우스 피하에 이식했다. 이식 후 형광강도 변화 및 부피변화는 1, 2, 4, 6, 8주에 확인하였다. 형광현미경을 통해서 지지체에 고르게 결합된 것을 확인하였고, Cy3 결합 전과 후의 1차아민 개수가 확연히 차이가 나는 것을 확인하였다. 체내에서는 초기 형광강도에 비해 8주까지 시간이 흐름에 따라 점차 그 강도가 약해지는 것을 확인할 수 있었다. 부피변화 역시 초기에 비해 줄어 든 것을 확인할 수 있었고, 현미경으로 분해 양상을 확인해 보면 초기 다공의 모양은 시간이 지나면서 그 형체가 무너지는 것을 확인하였고, 형광현미경을 통해서 보았을 때 역시 초기 형광강도에 비해 8주의 형광강도가 약해지는 것을 확인하였다. 본 연구를 통해 3차원 세포 외 기질 다공성 지지체에 형광결합을 함으로써 분해양상을 비침습적 실시간 모니터링 통해 확인할 수 있었고, 시간이 흐름에 따라 PCP 지지체의 분해가 이루어 진다는 것을 체내 실험으로 형광결합을 통해 이미징 시스템 장비를 이용하여 시간에 따라 형광 강도가 감소하는 것을 성공적으로 확인하였다. 또한 체내에서의 형광강도 감소가 실질적으로 PCP 지지체의 분해가 됐는지의 여부는 μCT 로 부피측정 및 현미경 사진을 통하여 모폴로지를 확인함으로써 알 수 있었다. 이것으로 콜라겐의 분해도를 통해, 전체 세포외기질의 분해를 확인할 수 있었다. 이러한 비침습적 실시간 모니터링 시스템은 지지체의 분해도 개요를 획득하는데 매우 유용하게 적용할 수 있을 것이라고 기대된다.