c-kit을 타깃하는 인간 2G4 항체에 대한 항-약물 항체의 제작 및 특성 분석

Abstract

Anti-drug antibody (ADA)는 체내에서 약물을 항원으로 인식하여 생성된 anti body를 말하며, 약물의 반복적인 투여로 인해 생성된다고 보고되어 있다. ADA는 환자에게 처방된 약물과 타깃의 결합을 억제하기 때문에 치료 효과가 감소한다. c-kit은 티로신 인산화 효소 수용체 (Receptor tyrosine kinase, RTK)로 세포내 신호 전달 경로와 관련이 있다. 줄기세포 성장 인자 (Stem cell factor, SCF) 수용 체인 c-kit은 주로 세포 분화와 혈관 신생 등을 유발하여 종양 발생을 유도한다. 이러한 이유로 c-kit의 신호 전달 경로는 항암 치료에 있어 중요한 포인트이며, 암의 증식과 생존을 효과적으로 억제할 수 있는 방법으로 c-kit의 신호 전달 경 로를 차단하는 연구가 활발히 진행 중이다. h2G4 IgG는 본 연구실에서 개발된 인간 단클론 anti-c-kit antibody로, c-kit이 주요 인자로 작용하는 암의 antibody 치료제로써 개발 중이다. 본 연구의 목적은 환자 혈청 내 h2G4 IgG의 존재 하에 서 면역 체계에 의한 anti-h2G4 antibody의 생성 유무를 확인할 수 있도록 표준 물질로서 anti-h2G4 antibody를 개발하는 것이며, 이렇게 개발된 antibody는 anti -h2G4 antibody의 생성 정도를 측정할 수 있는 기준점을 제공할 수 있다. 본 실험에서는 생쥐의 면역화를 통해 anti-h2G4(Fab) antibody를 제작하였으 며, competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)로 h2G4 IgG 중화 antibody를 선별하였다. Limiting dilution을 통해 단클론 h2G4 IgG 중화 antibody 를 확보하였고, antibody 동정을 위한 epitope binning을 통해 단클론 M2-4F2-4E9-1A2, M4-3F2-2D12을 선별하였다. 선별된 단클론 h2G4 IgG 중화 antibody 의 FACS 실험 결과, h2G4 IgG 중화 antibody는 h2G4 IgG와 c-kit의 결합을 감소 시켜 h2G4 IgG에 의한 SCF와 c-kit의 결합 차단 효과를 억제하였다. FACS와 western blot 실험을 통해 단클론 h2G4 IgG 중화 antibody는 세포에 비특이적 결합이 없음을 확인하였으며, h2G4 IgG 에 의한 c-kit의 세포내 신호 전달의 억제가 h2G4 IgG 중화 antibody에 의해 해소된 것을 확인하였고, p-c-kit의 level 변화를 통해 h2G4 IgG와 특이적으로 결합하여 중화하는 것을 확인하였다. 또 한 단클론 h2G4 IgG 중화 antibody는 p-Erk와 p-Akt의 변화에 영향이 없음을 확 인하였고, c-kit의 세포내 신호 전달과 무관함을 검증하였다. 따라서 M2-4F2-4E9-1A2와 M4-3F2-2D12는 h2G4 IgG만을 중화하는 anti-h2G4-idiotype antibody 임을 입증하였다. h2G4 IgG에 대해 특이적인 M2-4F2-4E9-1A2와 M4-3F2-2D12는 단백질 공학 등을 통해 인간화하여 h2G4 IgG 에 대한 ADA 생성 여부를 판단하는 기준점을 제공할 수 있다.