기관지 천식 환자의 말초혈액 단핵구 세포로부터 분리한 유전자를 이용한 재조합 인간 자가항체 개발 및 기능 검증

Abstract

목적 : 현재 비알레르기성 천식의 발병기전은 아직 명확하게 규명되지 못한 상태이다. 최근 비알레르기성 천식의 병인기전에 자가면역 기전이 관여할 가능성이 제시된 바 있으며 최근 기도상피세포의 주요 세포골격 구성 단백 질인cytokeratin 18(이하 CK-18) 단백질이 비알레르기성 천식 환자의 혈청 IgG 자가항체와 반응하는 주요 기도상피세포 자가항원 단백질임이 보고된 바 있다. 또한 비알레르기성 천식 환자의 혈액으로부터 분리된 전체IgG 자가항체가 배양된 기도상피세포에 대해 독성반응을 나타냄이 보고되었다. 이에 기도상피 세포 단백질 항원인 CK-18단백질에 대한 자가항체가 비알레르기성 천식의 병인기전에 관여할 가능성을 확인해보고자 본 연구를 시행하였다. 본 연구에서는 비알레르기성 천식 환자들의 말초혈액 단핵구 세포로부터 분리한 유전자를 이용하여 재조합 자가항체를 개발 및 제조하고 이를 이용하여 자가항체에 의한 기도상피세포 독성을 분석하고자 하였다.

재료 및 방법 : CK-18단백질에 대한 IgG 자가항체가 고역가로 검출되는 11명의 성인 비알레르기성 천식 환자들의 말초혈액 단핵구 세포로부터 total RNA를 분리하였다. 이를 이용하여 인간 항체 유전자 cDNA library를 구축하였고 phage-display방법을 이용하여 CK-18단백질에 대해 높은 항원반응 강도를 나타내는 유전자 재조합 자가항체들을 선별하여 single-chain variable fragment (scFv)와 IgG 형태로 생산 및 정제하였다. 최종적으로 분리된 인간 유전자 재조합 단클론 자가항체들은 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), immunoblot, immunofluore- scence를 통해 항원 반응성상을 분석하였으며3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphen yl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay 방법을 이용하여 배양된 기도상피세포주 (A549)에 대한 세포독성을 분석하였다.

결과 : 1. ELISA와 immunoblot, immunofluorescence를 이용한 항원반응 분석결과 양성 단클론 IgG 자가항체들은 CK-18단백질과 선택적으로 반응하였다. 특히 immunofluorescence staining 결과 양성 단클론 IgG 자가항체들의 사람 기도상피 세포주(A549)에 대한 반응양상은 CK-18단백질에 대한 마우스 단클론 항체의 반응양상과 일치하였다. 2. 세포독성 실험에서 양성 단클론 IgG 자가항체들은 음성 단클론 대조항체들에 비해 주요 세포골격 구성 단백질인CK-18단백질이 발현되는 사람 기도상피 세포주(A549)에 대해 유의하게 높은 세포독성을 나타내었다 (p < 0.05). 3. 양성 단클론 IgG 자가항체와 건강한 사람의 신선한 혈청으로부터 얻은 보체를 함께 처리하였을 경우 가열에 의해서 보체를 불활성화시킨 사람 혈청을 첨가한 경우에 비해서 세포독성이 유의하게 높음을 확인할 수 있었다 (p < 0.05). 4. 양성 단클론 IgG 자가항체의 기도상피세포에 대한 세포독성 기전을 annexin-v와 propidium iodide (PI) 염색을 이용한 flow cytometry 결과 양성 단클론 IgG 자가항체는 직접적으로 기도상피세포의 apoptosis를 유도함을 확인할 수 있었다.

결론 : CK-18단백질에 대한 인간 유전자 재조합 단클론 자가항체들은 기도상피 세포에 대하여 직접적인 세포독성을 나타내었으며, 보체 첨가시 자가항체에 의한 세포독성이 증가되었다. 이러한 결과들은 비알레르기성 천식환자의 혈액에 존재하는 기도상피세포 자가항원인 CK-18단백질에 대한 IgG 자가항체가 기도상피세포 독성과 보체활성화를 유도하여 비알레르기성 천식의 병인기전에 관여할 가능성을 시사한다.