혈액응고인자 VIII의 각 도메인에 대한 재조합 단백질의 합성 및 특성에 관한 연구

Abstract

혈액응고인자 VIII (Factor VIII; FVIII)은 혈액응고 과정에서 중요한 역할을 하는 단백질이다. 이 단백질의 유전자 (F8)에 발생한 돌연변이로 인해 정상적인 단백질이 발현되지 않거나 부족할 경우 혈액응고 장애를 유발하는 혈우병 A가 된다. FVIII은 von Willebrand Factor (vWF)와 결합하여 혈액 내에서 안정하게 존재하고 있다가 혈액응고 작용이 필요할 경우 vWF와 분리되고 FVIIIa로 활성화된 후 Factor IXa과 결합하여 Factor X를 통한 응고과정이 진행된다. FVIII은 분자량 300 kDa의 당단백질로 여러 도메인 (A1-A2-B-A3-C1-C2)으로 구성되어 있다. 각 도메인은 고유한 기능을 수행할 것으로 예상하고 있으나 그 기능에 대한 보고는 아직 없다. 그러므로 본 연구에서는 FVIII의 각 도메인의 기능을 연구하기 각 도메인 별로 재조합 단백질을 발현하였다. 이를 위하여 각 도메인의 유전자들을 클로닝하였고, 이것을 GST 발현 벡터에 삽입시켰다. 재조합된 각 벡터로부터 단백질 발현의 최적상태를 조사하기 위하여 IPTG 농도, 발현 유도 온도, 및 발현 유도 시간에 따른 발현량을 조사하였다. 각각의 재조합 단백질을 최적화한 조건에서 발현시킨 다음, DEAE 이온교환수지 컬럼으로 분리하고, glutathione bead로 정제하였다. 이렇게 정제된 각 도메인 단백질에 결합하는 단백질들을 조사하였다. 순수 분리한 재조합 단백질을 recombinant Factor IX (rFIX)과 결합시켜 본 결과 A2 도메인 단백질이 융합된 GST 재조합 단백질이 rFIX와 결합하는 것을 확인함으로써 재조합 단백질이 예상대로 작용한다는 것을 알 수 있었다. 이 결과를 바탕으로 하여 FVII의 각 도메인에 대한 재조합 단백질을 이용하여 혈장 내에 이와 결합하는 단백질들을 찾아내는데 사용할 수 있을 것으로 기대된다.