LC-MS/MS를 이용한 혈액내 세파클러 고효율분석

Abstract

세파클러(Cefaclor,monohydrate, 3-Chloro-7-D-(2-phenylglycinamido)-3-cepham-4-carboxylic acid, monohydrate)는 cephalosporin계 반합성 유도체로서 세균의 세포벽 합성을 저해하여 살균작용을 나타내는 제 2세대 경구용 항생제이다. 1세대 경구용 세파계 항생제와 같이 호흡기, 비뇨기, 피부과 영역의 경증 내지 중증도의 세균감염에 이용된다. 본 연구에서는 cefaclor제제를 기존에 널리 알려진 HPLC-UV를 이용하여 분석을 진행할 경우 분석시간의 증가(Run time 15분) 및 cefaclor의 감도향상에 대한 분석방법의 정확도를 향상시키기 위해서 LC-MS/MS를 이용하여 분석방법을 진행하기로 하였다. 약물분석기기로는 API-3000 (Applied Biosystems, U.S.A.)를, column은 Symmetry Shield RP18(3.5㎛, 2.1 × 100mm, Waters, Ireland)를 이용하였으며, MRM (Multiple Reaction Monitoring) mode의 경우 Positive ion 모드로 진행하였다. cefaclor의 m/z는 368.1 → 174.2였으며, 내부표준물질인 Cephalexin의 m/z는 348.2 → 158.1 임을 확인 할 수 있었다. 기기조건으로는 Collision Energy(CE)이 21 V였으며, Collision Gas (CAD) : 9 ㎖/min으로 설정하였다. 또한 Nebulizer Gas (NEB)은 8 ㎖/min, Curtain Gas (CUR)값은 9 ㎖/min. Ion Spray Voltage (IS)는 5500 V, Temperature (TEM)는 500℃으로 조건을 설정하여 분석을 진행하였다. DP값은 41.0, EP값은 11.0, CE값은 21.0 CXP는 12.0로 조건을 설정하였다. validation 진행은 검량선 농도인 0.5, 1, 2.5, 5, 10, 20 ㎍/㎖로 진행하였으며, 직선성 확인결과 가중치(1/x)를 적용하여 얻은 혈장시료로부터 구한 세파클러의 검량선 계산식은 일내에서는 y = 0.04 x + 0.000315 (r= 0.9997), 일간에서는 y = 0.0383 x - 0.000341 (r= 0.9982)로 0.5~20.0 ㎍/㎖ 범위에서 양호한 직선성을 나타내었다. 정확성 및 정밀성은 일간 및 일내에서 15%이내임을 확인할 수 있었으며, 안정성 진행의 경우 0.5, 2.5, 10 ㎍/㎖의 농도에서 진행하였으며, 특이성 및 24시간 조제 후 안정성, 단기온도 안정성(4 hr), 표준원액안정성(6 hr), 3회 냉,해동 안정성 및 장기온도 안정성(30 day)모두 기준으로부터 15%이내임을 확인할 수 있었다. Carry Over의 경우 없는 것을 확인하였다. validation 및 안정성 확인 결과 세파클러의 분석방법에 대해 신뢰할 수 있었으며, 분석시간의 감소(3 min) 및 감도향상으로 인해 injection volume의 감소로 상대적인 효율이 높음을 입증할 수 있었으며, 기기변경에 따른 새로운 분석조건은 생체 내 세파클러 제제의 분석에 매우 적합하다는 것을 증명할 수 있었다.