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Graduate School of Ajou University Department of Medicine 3. Theses(Master)

조골세포 사멸 및 분화에서 GSK3b의 역할

DC Field Value Language
dc.contributor.advisor정윤석-
dc.contributor.authorYun, Sun-Il-
dc.date.accessioned2019-10-21T07:13:26Z-
dc.date.available2019-10-21T07:13:26Z-
dc.date.issued2010-02-
dc.identifier.other10491-
dc.identifier.urihttps://dspace.ajou.ac.kr/handle/2018.oak/17436-
dc.description학위논문(박사)--아주대학교 일반대학원 :의학과,2010. 2-
dc.description.tableofcontentsABSTRACT •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• i TABLE OF CONTENTS ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• iii LIST OF FIGURES ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• vii I. INTRODUCTION ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 1 A. Wnt/-catenin signaling ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 3 B. GSK3 in apoptosis••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 5 C. p38-mitogen-activated protein kinase in apoptosis •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 5 D. Bcl-2 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 6 E. Heat Shock Protein 25 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 7 F. Aims of this study ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 10 II. MATERIALS AND METHODS •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 11 A. MATERIALS ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 11 1. Reagents ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 11 2. Materials •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 11 B. METHODS ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 12 1. Cell culture •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 12 2. Cell viability assay ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••12 3. Trypan blue staining ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 12 4. Mitochondrial membrane potential Analysis ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••12 5. Fluorescence staining •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••13 6. Tdt-mediated dUTP-biotin nick End Labeling staining ••••••••••••••••••••••••••••••••13 7. Caspase-3 activity •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••14 8. Western blot analysis •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 14 9. Small interference RNA transfection •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••15 10. Reverse transcription •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 15 11. Polymerase chain reaction •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••15 12. Alkaline phosphatase activity ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 16 13. Alizarin red S staining •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 16 14. Luciferase activity ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 17 15. Statistical analysis ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 17 Part I. Glucocorticoid induces apoptosis of osteoblasts through the activation of glycogen synthase kinase 3β •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••18 III. RESULTS •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••19 1. Dex induces apoptosis of osteoblasts through caspase activation •••••••••••••••••• 19 2. Glucocorticoid receptor mediates Dex-induced apoptosis in osteoblasts ••••••••••21 3. Dex induces GSK3β activation in osteoblasts ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 24 4. GR stimulated by Dex reglates the phosphorylation of GSK3 •••••••••••••••••••• 25 5. Dex activates p38-MAP in osteoblasts •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 25 6. Gene knock-down of GSK3β and p38-MAPK •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 31 IV. DISCUSSION •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 33 Part II. Glycogen synthase kinase-3β regulates etoposide-induced apoptosis via Bcl-2 mediated caspase-3 activation in C3H10T1/2 cells••••••••••••••••••••••••••••••••• 37 III-B. RESULTS •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 38 1. Etoposide induces apoptosis in C3H10T1/2 cells ••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 38 2. Etoposide induces osteoblast apoptosis via GSK3β activation, which is prevented by gene silencing •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••41 3. Etoposide induces apoptosis via GSK3β activation, which is prevented by gene silencing•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 44 4. Bcl-2 is mediated by GSK3β in etoposide-induced apoptosis ••••••••••••••••••••••• 47 IV. DISCUSSION ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 49 Part III. Dexamethasone regulates osteocalcin via heat shock protein 25 and GSK3β in osteoblast Differentiation ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 51 III. RESULTS •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 54 1.The expression of HSP25 during osteoblasts differentiation ••••••••••••••••••••••••• 58 2.Effects of Dex on osteocalcin expression in osteoblasts •••••••••••••••••••••••••••••• 58 3.Effects of knock-down of HSP25 on osteocalcin in osteoblasts ••••••••••••••••••••• 58 4.Lithium controls expression of HSP25 and osteocalcin ••••••••••••••••••••••••••••••• 62 IV. DISCUSSION ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 63 V.CONCLUSION ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 67 REFERENCES••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 69 국문요약 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 79-
dc.language.isoeng-
dc.publisherThe Graduate School, Ajou University-
dc.rights아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.-
dc.title조골세포 사멸 및 분화에서 GSK3b의 역할-
dc.typeThesis-
dc.contributor.affiliation아주대학교 일반대학원-
dc.contributor.alternativeNameSun Il Yun-
dc.contributor.department일반대학원 의학과-
dc.date.awarded2010. 2-
dc.description.degreeMaster-
dc.identifier.localId568457-
dc.identifier.urlhttp://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000010491-
dc.subject.keywordOsteobalsts-
dc.subject.keywordApoptosis-
dc.subject.keywordDexamethasone-
dc.subject.keywordGSK3b-
dc.subject.keywordp38 MAPK-
dc.subject.keywordEtoposide-
dc.subject.keywordDifferentiation-
dc.subject.keywordHSP25-
dc.subject.keywordOsteocalcin-
dc.subject.keyword조골세포-
dc.subject.keyword사멸-
dc.subject.keyword분화-
dc.description.alternativeAbstractDfferentiation of osteoblasts is critically involved in bone formation and requires several signal pathways. One of the important pathways is the Wnt signaling where GSK3 plays a key role in regulation of β-catenin activity, a major effector, through phosphorylation. Glucocorticoids (GCs) are known to induce osteoporosis via a decrease of differentiation and apoptosis of osteoblasts and osteocytes in part. However, the detailed mechanism of GC-induced osteoporosis has not been clearly determined. This study showed that dexamethasone (Dex) induced apoptosis of MC3T3-E1 osteoblasts through the GC receptor. Dex activated GSK3β, and inhibition of GSK3β by lithium, a pharmacological antagonist, or gene knock-down by siRNA prevented the Dex-induced apoptosis. Unexpectedly, Dex also activated p38 mitogen-activated protein kinase (p38 MAPK); however, the inhibition of p38 MAPK further increased apoptosis in Dex-treated osteoblasts. These results suggest that p38 MAPK might protect against Dex-induced apoptosis of osteoblasts. Etoposide, a genotoxic agent, increased apoptosis of C3H10T1/2 osteoblast progenitor cells by the activation of both caspase-3 and GSK3β. The pharmacological inhibition (lithium) or gene knock-down (siRNA) of GSK3β protected the cells from apoptosis. This is quite similar to the results of Dex-induced apoptosis. In addition, etoposide decreased expression of Bcl-2, an anti-apoptotic protein, in the C3H10T1/2 cells. LiCl completely recovered the Bcl-2 expression as shown by both the mRNA and the protein expression levels. It has recently been reported that Dex decreases differentiation and mineralization of osteoblasts, but its mechanism is not certainly understood. The present study also showed that Dex were associated with osteoblast differentiation by employing MC3T3-E1 cells, an osteoblast cell line. Dex decreased osteocalcin mRNA level compared to that of un-treated cells at an early differentiation period. Interestingly, Dex continuously accumulated the expression of heat shock protein 25 (HSP25). Gene knock-down of HSP25 by siRNA recovered osteocalcin expression up to control level. Furthermore, treatment with lithium decreased HSP25 expression and also recovered osteocalcin expression. These results suggest that HSP25 induction was associated with osteoblast differentiation via osteocalcin modulation and mediated by GSK3β. In summary, Dex-induced GSK3β activation triggered apoptosis of osteoblasts and was associated with osteoblast differentiation. Therefore, GSK3β appears to play a key role in the fate and function of osteoblasts. The results of this study provide additional insights into the pathogenic mechanism of GC-induced osteoporosis.-
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