체내에서 토끼 중간엽 줄기세포의 연골분화에 저강도 초음파가 미치는 영향

Abstract

본 실험에서는 저강도 초음파가 골수 유래 중간엽 줄기세포(MSCs)의 연골분화에 미치는 영향을 연구하였다. 본 연구에서는 저강도 초음파가 비침습적인 생물학적 자극으로 중간엽 줄기세포의 연골분화를 유도하고 촉진하는데 효과적일 것이라 는 가설을 세웠다. 중간엽 줄기세포는 뉴질랜드 흰색토끼 골수로부터 획득하였고 체외에서 2 주간 단층 배양하였다. 단층 계대배양하여 얻은 세포를 회수하여 5x106의 농도로 polyglycolic acid (PGA)에 접종하여 chondrogenic defined media에서 체내에 이식하기 전 일주일간 체외배양하였다. 실험 Ⅰ 에서는 체외에서 배양한 PGA-MSCs 구조물을 누드마우스 등 피하조직에 이식하고 초음파군은 매일 20분 씩 4주간 누드마우스 등에 직접 초음파자극을 주었고 대조군은 초음파 자극을 주지 않았다. 실험 Ⅱ 에서는 PGA-MSCs 구조물을 아무런 치료를 하지 않은 대조 군, 초음파군, TGF군, 초음파/TGF군으로 나누고, 초음파군은 매일 20분씩, TGF군 은 10ng/ml 농도의 TGF-β1으로 일주일 동안 전처리를 거치고 누드마우스 등 피 하조직에 이식하였다. 실험 Ⅲ 에서는 PGA-MSCs 구조물을 체내에 이식하기 전 일주일 동안 체외에서 매일 20분씩 초음파 전처리를 거쳐서 토끼 관절연골 결손 모델에 이식하였다. 대조군으로는 초음파 전처를 거치지 않은 그룹으로 하였다. 실험 Ⅱ 과 Ⅲ 에서는 PGA-연골세포 이식물을 양성 대조군으로 사용하였다. PGA- 세포 구조물을 체내에 이식한 후 부동한 시기에 육안적, 조직학적, 생화학적 분 석, 역학적 검사와 RT-PCR 분석을 진행하고 정량 분석은 통계학적 처리를 거쳤 다. 총 DNA 함량은 초음파군과 대조군에서 큰 차이를 보이지 않았으며 전체 교 원질 및 단백당의 농도는 초음파 그룹에서 대조군 보다 현저하게 증가하는 것을 볼 수 있었다. Safranin O 조직학적 염색에서도 초음파를 준 군에서 연골분화가 더 많은 면적에서 더 강하게 발현되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 체내에 이식하 기 전 유전자 발현을 보았을 때, Sox-9, aggrecan, TIMP-2 유전자 발현 수준은 초음 파 군에서 더 강하게 발현되었고, 제 Ⅰ, X 형 교원질, MMP-13 발현은 초음파를 주지 않은 그룹에서 현저히 강하게 발현되었다. TGF군과 대조군 사이에서는 큰 차이를 보이지 않았다. 토끼 관절 연골 결손 모델에서, 조직학적 및 면역조직학 적염색으로 관찰하였을 때, 초음파 군은 대조군 보다 제2형 교원질 및 단백 다당 이 더 많은 면적에서 더 강하게 발현되었다. 본 실험을 통하여 저강도 초음파는 체내에서 직접적인 자극을 주거나 혹은 체외에서 저강도 초음파의 전처리는 체 내에서의 중간엽 줄기세포의 연골분화를 촉진시키는데 효과적임을 증명하였다.