사람포피세포와 Huh7 간암세포주에서 BTG2_(TIS21/PC3) 유전자발현조절에 의한 세포노화유도 연구

DC Field Value Language
dc.contributor.advisor임인경-
dc.contributor.author강소영-
dc.date.accessioned2019-10-21T06:48:51Z-
dc.date.available2019-10-21T06:48:51Z-
dc.date.issued2008-02-
dc.identifier.other6666-
dc.identifier.urihttps://dspace.ajou.ac.kr/handle/2018.oak/17027-
dc.description학위논문(석사)----아주대학교 일반대학원 :의학과,2008. 2-
dc.description.abstract목적: TIS21 (TPA inducible sequences 21)는 mouse, BTG2 (B-cell translocation gene-2)는 human, PC3 (pheocromocytoma clone-3)는rat에 존재하는 동등 유전자이고, anti-proliferative gene family에 속한다. TIS21BTG2/PC3는 세포 내에서 전사보조인자, 신경세포 분화인자 및 성장 억제인자로서 thymocyte 의 stage-specific expansion 을 매개하는 중요인자이고 조혈모세포 증식억제인자로 보고된 바 있다. 사람과 생쥐에서 암 억제유전자이고 세포증식을 억제하는 pan-cell cycle regulator로서의 기능을 하는 사실 등은 TIS21 유전자가 세포노화에 관련이 있음을 시사한다. 본 연구실에서는 이미 293 세포에서 TIS21 과발현을 유도하면 세포증식이 떨어지고 세포의 크기가 증가하는 현상을 보고한 바도 있다. 이때 그 기전으로서는 TIS21 과발현에 의하여 cyclin E와 cyclin-dependent kinase (cdk) 4 의 합성이 감소할 뿐만 아니라 G1-S transition때 cdk activity도 현저하게 감소함이 널리 인정되었다. 본 연구에서는 세포의 자연노화 및 유도노화 과정 중에 TIS21BTG2/PC3의 발현이 증가하는 현상을 통해서 TIS21BTG2/PC3 에 의해 노화 현상이 유도되는 것인지 아니면 유지되는 것인지, 또한 이런 현상은 어떤 기전을 통해서 이뤄지는 것인지 알아보고자 하였다. 재료 및 방법: 젊은 HDF 세포를 계대배양하면서 replicative senescence를 유도하고, Huh7 세포에 200 μM H₂O₂의 농도로 한 번 또는 반복적으로 처리하여 조기노화세포를 만들었다. 정상 생쥐와 TIS21-/- 생쥐의 태아에서 MEF세포를 분리하였다. 세포노화의 진행 정도는 Senescence associated-β-galactosidase assay (SA-β-gal)와 세포성장율 측정으로 표현하였다. 단백질의 발현과 세포 내 위치변화는 immunoblotting과 면역형광염색을 수행하여 측정하였다. 세포 내 TIS21BTG2 발현양은 RT-PCR, Real-time PCR로 측정하였다. 활성산소양은 2’7’-dichlorofluorescin diacetate로 염색하여 fluorescence activated cell sorter (FACS)로 측정하였으며, 미토콘드리아 막의 전위차는 JC-1 염색 후 FACS 형광 측정을 하였다. 결과: 1. 젊은 HDF 세포를 계대배양하여 replicative senescence가 진행되는 세포에서 SA-β-gal 활성이 증가하고, 세포성장율이 떨어지는 것을 관찰할 수 있었고, 노화표지자인SA-p-Erk1/2의 발현이 노화된 HDF 세포에서 증가하는 것을 확인하였으며, 이때 BTG2 mRNA의 발현이 증가하는 것을 관찰하였다. 2. H₂O₂ 를 단독 또는 반복적으로 처리한 경우 Huh7세포의 크기가 증가하였고, 세포성장율이 떨어지면서 SA-β-gal 활성과 핵 내 actin의 축적양이 증가하는 것을 면역형광법으로 관찰하였으며, BTG2 mRNA의 발현이 증가하는 것을 RT-PCR로 측정하였다. 3. TIS21 유전자를 발현하는 Huh7 세포에서 성장율이 현저하게 감소하였으며, SA-β-gal 활성이 증가하였고, SA-p-Erk1/2의 발현도 증가되어 있는 것을 관찰하였다. 4. 정상생쥐와 TIS21-/- 생쥐의 태아에서 각각 TIS21+/+ MEF와 TIS21-/- MEF를 분리해서 TIS21-/-된 것을 RT-PCR로 확인하였고, TIS21-/- MEF는 TIS21+/+ MEF보다 성장율이 좋은 것을 관찰하였다. 또한, SA-β-gal 활성도 감소되어 있었다. H₂O₂를 처리하였을 때 SA-β-gal 활성이 TIS21-/- MEF에서 TIS21+/+ MEF보다 감소되어 있었다. 5. Adenovirus로 TIS21을 과발현시킨 Huh7세포 내에 활성산소의 양은 차이가 없었지만, 미토콘드리아 막의 전위차가 감소되어 있었으며, MnSOD의 발현이 증가되어 있는 것을 관찰하였다. 이때, Huh7 세포에 doxorubicin을 처리하면 SA-β-gal 활성과 활성산소의 발현양이 증가되는 것을 관찰하였다. 결론: 젊은 HDF 세포를 계대배양으로 노화시키는 경우와 Huh7 세포에 H₂O₂ 를 처리하여 조기노화를 유도한 세포에서 노화가 진행되었음을 여러 가지 노화표지자로 측정하였고, 이러한 세포에서 BTG2TIS21/PC3 발현이 증가되어 있는 것을 관찰함으로써 노화과정과 BTG2^(TIS21/PC3)의 기능 사이에 관계가 있음을 알게 되었다. 이러한 기전은TIS21 유전자가 계속적으로 발현되는 세포와 TIS21-/- MEF를 이용해서 BTG2^(TIS21/PC3)발현증가와 노화과정진행이 연관되어 있음을 알 수 있었다. BTG2^(TIS21/PC3)에 의해서 노화과정이 유도될 때 어떠한 변화가 생기는지 알아보고자 세포 내 활성산소의 양과 미토콘드리아 막의 전위차를 측정한 결과, adenovirus를 이용해 TIS21을 과발현 시켰을 때 세포 내 활성산소의 양은 대조표준과 차이가 없었지만, 미토콘드리아 막의 전위차가 약간 감소하였으며 MnSOD 발현양이 증가되었다. Adenovirus를 이용해 TIS21을 과발현 시키고 doxorubicin을 처리하였을 때 SA-β-gal 활성이 대조표준보다 증가되었고, 세포 내 활성산소의 양이 약간 증가하였다. 이를 통해서 BTG2TIS21/PC3 에 의해서 세포노화가 유도되고, 이러한 현상은 BTG2TIS21/PC3 단독 효과만으로는 부진하지만, doxorubicin이나 H₂O₂와 같은 DNA손상유도물질을 동반 처리하면 세포노화유도가 촉진되는 것을 알 수 있었다. 결과적으로, BTG2^(TIS21/PC3) 과발현을 유도하여 암세포 노화를 촉진함으로써, 암세포의 빠른 증식을 지연 또는 억제시켜 암세포 치료의 효과에 도움이 될 것이라 기대된다.-
dc.description.tableofcontents국문요약 ― = ⅰ 그림 차례 = ⅵ I. 서론 = 1 A. 세포노화 = 1 B. TIS21^(BTG2/PC3) = 3 II. 재료 및 방법 = 6 A. 사람 포피 세포 분리, Human Diploid Fibroblast (HDF) 세포 = 6 B. 생쥐 태아 섬유모세포 분리, Mouse Embryo Fibroblast (MEF) 세포 = 7 C. Huh7세포에 TIS21 complementary DNA (cDNA) transfection = 7 D. 세포 수 집계 (Cell number counting) = 8 E. TIS21 adenovirus = 8 F. Doxorubicin-induced senescence = 8 G. Senescence associated-β-galactosidase (SA-β-gal) assay = 9 H. 면역형광세포염색 (Immunocytochemistry) = 9 I. RNA분리와 RT-PCR = 10 J. Real-time PCR = 11 K. 세포 내 활성산소 (ROS)의 양 측정 = 12 L. 미토콘드리아 막 전위차 (mitochondrial membrane potential) 측정 = 13 M. 미토콘드리아 염색 = 13 N. Western blot analysis = 14 O. 통계처리 = 15 III. 결과 = 16 A. 노화된 세포에서 BTG2^(TIS21)의 발현증가 = 16 B. TIS21^(BTG2)과발현에 의한 노화현상유도 = 17 C. TIS21^(BTG2) 과발현에 의한 노화현상유도로 나타나는 생화학적 변화 = 18 IV. 고찰 = 33 V. 결론 = 37 참고문헌 = 38 ―ABSTRACT― = 47-
dc.language.isokor-
dc.publisherThe Graduate School, Ajou University-
dc.rights아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.-
dc.title사람포피세포와 Huh7 간암세포주에서 BTG2_(TIS21/PC3) 유전자발현조절에 의한 세포노화유도 연구-
dc.title.alternativeKang, So Young-
dc.typeThesis-
dc.contributor.affiliation아주대학교 일반대학원-
dc.contributor.alternativeNameKang, So Young-
dc.contributor.department일반대학원 의학과-
dc.date.awarded2008. 2-
dc.description.degreeMaster-
dc.identifier.localId566668-
dc.identifier.urlhttp://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000006666-
dc.subject.keyword사람포피세포-
dc.subject.keyword간암세포-
dc.subject.keyword유전자발현-
dc.subject.keyword세포노화-
dc.description.alternativeAbstractTIS21^(BTG2/PC3) regulates G1-S and G2-M progressions of cell division cycle through the inhibition of G1 phase cyclin biosynthesis, and the delayed degradations of cycin B1 and cyclin A, respectively. Therefore, we earlier suggested that TIS21 might play a role as a pan-cell cycle regulator and an important factor for cellular senescence. However, there has been no experimental evidence to confirm TIS21 as a regulator of cellular senescence. In this study, we observed the changes of TIS21 expression in the replicative senescence of human diploid fibroblast (HDF) cells. Furthermore, when we treated Huh7 hepatoma cells with H₂O₂, the expression of BTG2 mRNA was highly induced, accompanied with senescence phenotypes. To investigate a role of TIS21 in the process of cellular senescence, Huh7 cells were transfected with TIS21 cDNA construct. The followings were observed; Growth of the Huh7 cells was significantly decreased, cell shapes were changed from small and cylindrical young cell-like to large and flat cells, and percentages of the cells with senescence associated (SA)-β-galactosidase activity were significantly increased after adeno-TIS21-HA virus infection to Huh7 cells. Mouse embryonic fibroblast (MEF) cells derived from TIS21+/+ and TIS21-/- mice showed that the SA-β-gal activity was significantly increased in TIS21+/+ MEF cells of passage 10 compared with that of TIS21-/- MEF cells. And growth of the MEF cells was significantly increased in TIS21-/- MEF cells of passage 3 compared with that of TIS21+/+ MEF cells. Furthermore, over-expression of TIS21 induced MnSOD expression and decreased mitochondrial membrane potential (MMP) difference in Huh7 cells after combined treatment with doxorubicin. The above data suggest that TIS21 might induce cellular senescence phenotypes both in HDF and Huh7 cells.-
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Graduate School of Ajou University > Department of Medicine > 3. Theses(Master)
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