사람포피세포와 Huh7 간암세포주에서 BTG2_(TIS21/PC3) 유전자발현조절에 의한 세포노화유도 연구

Abstract

목적: TIS21 (TPA inducible sequences 21)는 mouse, BTG2 (B-cell translocation gene-2)는 human, PC3 (pheocromocytoma clone-3)는rat에 존재하는 동등 유전자이고, anti-proliferative gene family에 속한다. TIS21BTG2/PC3는 세포 내에서 전사보조인자, 신경세포 분화인자 및 성장 억제인자로서 thymocyte 의 stage-specific expansion 을 매개하는 중요인자이고 조혈모세포 증식억제인자로 보고된 바 있다. 사람과 생쥐에서 암 억제유전자이고 세포증식을 억제하는 pan-cell cycle regulator로서의 기능을 하는 사실 등은 TIS21 유전자가 세포노화에 관련이 있음을 시사한다. 본 연구실에서는 이미 293 세포에서 TIS21 과발현을 유도하면 세포증식이 떨어지고 세포의 크기가 증가하는 현상을 보고한 바도 있다. 이때 그 기전으로서는 TIS21 과발현에 의하여 cyclin E와 cyclin-dependent kinase (cdk) 4 의 합성이 감소할 뿐만 아니라 G1-S transition때 cdk activity도 현저하게 감소함이 널리 인정되었다. 본 연구에서는 세포의 자연노화 및 유도노화 과정 중에 TIS21BTG2/PC3의 발현이 증가하는 현상을 통해서 TIS21BTG2/PC3 에 의해 노화 현상이 유도되는 것인지 아니면 유지되는 것인지, 또한 이런 현상은 어떤 기전을 통해서 이뤄지는 것인지 알아보고자 하였다. 재료 및 방법: 젊은 HDF 세포를 계대배양하면서 replicative senescence를 유도하고, Huh7 세포에 200 μM H₂O₂의 농도로 한 번 또는 반복적으로 처리하여 조기노화세포를 만들었다. 정상 생쥐와 TIS21-/- 생쥐의 태아에서 MEF세포를 분리하였다. 세포노화의 진행 정도는 Senescence associated-β-galactosidase assay (SA-β-gal)와 세포성장율 측정으로 표현하였다. 단백질의 발현과 세포 내 위치변화는 immunoblotting과 면역형광염색을 수행하여 측정하였다. 세포 내 TIS21BTG2 발현양은 RT-PCR, Real-time PCR로 측정하였다. 활성산소양은 2’7’-dichlorofluorescin diacetate로 염색하여 fluorescence activated cell sorter (FACS)로 측정하였으며, 미토콘드리아 막의 전위차는 JC-1 염색 후 FACS 형광 측정을 하였다. 결과: 1. 젊은 HDF 세포를 계대배양하여 replicative senescence가 진행되는 세포에서 SA-β-gal 활성이 증가하고, 세포성장율이 떨어지는 것을 관찰할 수 있었고, 노화표지자인SA-p-Erk1/2의 발현이 노화된 HDF 세포에서 증가하는 것을 확인하였으며, 이때 BTG2 mRNA의 발현이 증가하는 것을 관찰하였다. 2. H₂O₂ 를 단독 또는 반복적으로 처리한 경우 Huh7세포의 크기가 증가하였고, 세포성장율이 떨어지면서 SA-β-gal 활성과 핵 내 actin의 축적양이 증가하는 것을 면역형광법으로 관찰하였으며, BTG2 mRNA의 발현이 증가하는 것을 RT-PCR로 측정하였다. 3. TIS21 유전자를 발현하는 Huh7 세포에서 성장율이 현저하게 감소하였으며, SA-β-gal 활성이 증가하였고, SA-p-Erk1/2의 발현도 증가되어 있는 것을 관찰하였다. 4. 정상생쥐와 TIS21-/- 생쥐의 태아에서 각각 TIS21+/+ MEF와 TIS21-/- MEF를 분리해서 TIS21-/-된 것을 RT-PCR로 확인하였고, TIS21-/- MEF는 TIS21+/+ MEF보다 성장율이 좋은 것을 관찰하였다. 또한, SA-β-gal 활성도 감소되어 있었다. H₂O₂를 처리하였을 때 SA-β-gal 활성이 TIS21-/- MEF에서 TIS21+/+ MEF보다 감소되어 있었다. 5. Adenovirus로 TIS21을 과발현시킨 Huh7세포 내에 활성산소의 양은 차이가 없었지만, 미토콘드리아 막의 전위차가 감소되어 있었으며, MnSOD의 발현이 증가되어 있는 것을 관찰하였다. 이때, Huh7 세포에 doxorubicin을 처리하면 SA-β-gal 활성과 활성산소의 발현양이 증가되는 것을 관찰하였다. 결론: 젊은 HDF 세포를 계대배양으로 노화시키는 경우와 Huh7 세포에 H₂O₂ 를 처리하여 조기노화를 유도한 세포에서 노화가 진행되었음을 여러 가지 노화표지자로 측정하였고, 이러한 세포에서 BTG2TIS21/PC3 발현이 증가되어 있는 것을 관찰함으로써 노화과정과 BTG2^(TIS21/PC3)의 기능 사이에 관계가 있음을 알게 되었다. 이러한 기전은TIS21 유전자가 계속적으로 발현되는 세포와 TIS21-/- MEF를 이용해서 BTG2^(TIS21/PC3)발현증가와 노화과정진행이 연관되어 있음을 알 수 있었다. BTG2^(TIS21/PC3)에 의해서 노화과정이 유도될 때 어떠한 변화가 생기는지 알아보고자 세포 내 활성산소의 양과 미토콘드리아 막의 전위차를 측정한 결과, adenovirus를 이용해 TIS21을 과발현 시켰을 때 세포 내 활성산소의 양은 대조표준과 차이가 없었지만, 미토콘드리아 막의 전위차가 약간 감소하였으며 MnSOD 발현양이 증가되었다. Adenovirus를 이용해 TIS21을 과발현 시키고 doxorubicin을 처리하였을 때 SA-β-gal 활성이 대조표준보다 증가되었고, 세포 내 활성산소의 양이 약간 증가하였다. 이를 통해서 BTG2TIS21/PC3 에 의해서 세포노화가 유도되고, 이러한 현상은 BTG2TIS21/PC3 단독 효과만으로는 부진하지만, doxorubicin이나 H₂O₂와 같은 DNA손상유도물질을 동반 처리하면 세포노화유도가 촉진되는 것을 알 수 있었다. 결과적으로, BTG2^(TIS21/PC3) 과발현을 유도하여 암세포 노화를 촉진함으로써, 암세포의 빠른 증식을 지연 또는 억제시켜 암세포 치료의 효과에 도움이 될 것이라 기대된다.