이종 loxP 간 재조합 반응 산물에서의 spacer 부위 염기 서열 분석

Abstract

목적 : 부위특이적 재조합 (site-specific recombination) 방법의 하나인 Cre-loxP 시스템에서, mutant loxP 간의 재조합 반응 시 spacer region 염기 서열을 분석한다. 또한 heterologous (mutant) loxP 간의 반응 시 spacer region의 염기 서열 분석을 통하여 Cre 매개 재조합 메카니즘의 이해를 넓힌다.

재료 및 방법 : 두 lox site 사이의 Cre 매개 재조합 반응으로 나타나는 spacer region의 염기 서열 분석을 위하여 새로운 벡터 pFGB를 제작하였다. 2272, M2, M3, M7, M11으로 총 25개의 pFGB-lox1/lox2 조합을 구성했다. Cre를 발현하는 BS1365 박테리아 내로 이 plasmid들을 형질전환하고 37℃에서 하룻밤 배양한 후, BS1365로부터 plasmid DNA를 분리하였다. 분리된 DNA를 JM109 박테리아에 형질전환하고 ampicillin, X-gal, IPTG를 포함하는 LB agar plate에 도말하여 배양하였다. 그 중 청색 콜로니만 선별하여 염기 서열 분석을 통해 lox site의 spacer region 염기 서열을 확인했다.

결과 : pFGB 벡터 내로 2272, M2, M3, M7, M11을 클로닝 하여 25개 pFGB-lox1/lox2를 얻었다. Cre를 발현하는 박테리아 BS1365를 이용하여 생긴 재조합 산물의 염기 서열을 각각 10개씩 확인하였다. 염기 서열을 확인한 재조합 산물 중 우리가 예측하지 않았던 특이한 재조합물 (aberrant recombinant)을 선별하였다.

결론 : 총 25개의 mutant/mutant 조합 (2272, M2, M3, M7, M11)으로 heterologous loxP 간 재조합 산물의 ‘spacer region' 염기 서열을 분석하였다. 분석 결과, 재조합 메카니즘에 의해 예측되어지는 재조합 산물 외에 자기 lox site의 spacer region 염기 서열을 보이는 재조합 산물이 관찰되어졌다. 이 재조합 산물의 발생 원인에 대한 메카니즘 연구가 필요하며, 재조합 산물 중 TGATACCA, AGATACCT, AGATACCC의 결과는 돌연변이 (mutation)으로 추정한다.