Sonic hedgehog induces Motor Neuron Differentiation in P19 Embryonic Carcinoma Cells

Abstract

Sonic hedgehog (Shh) 은 포유동물의 발생과정에서 Central neuvous system (CNS)의 초기 dorso-ventral 형성 과정을 유도하는 morphogen 으로서 알려졌다. 이것은 Notochord 와 floor plate 으로부터 분비되고 여러 Hh 들 중의 하나이다. 또한, Shh 은 Full length 로 발현되어 N-말단과 C-말단으로 나뉘게 된다. 여기서 ShhN-말단이 기능적인 부분으로 발생초기에 도파민성 신경세포와 운동신경세포의 분화를 유도하는 것으로 알려져 있다. 이것이 세포 밖으로 분비되어 수용체인 Patched 에 결합하면 Shh 과 관련된 세포 신호 전달이 시작된다. 최근, CNS 발달 과정 중에서 Shh 은 Oligodendrocyte 와 운동신경세포뿐만 아니라 신경전구세포의 증식과 신경돌기의 조절과 같은 다양한 세포의 특징을 결정하는 기능을 한다고 알려졌다. 본 연구에서 신경세포 분화에서 Shh 의 기능을 연구하기 위해 in vitro 에서 P19 세포를 이용하였다. P19 세포는 배아 줄기세포처럼 세배엽으로 모두 분화 할 수 있는 능력을 지녔으며 배양하기가 매우 용이 하다는 장점을 가졌다. 일반적으로 P19 세포의 분화 유도는 retinoic acid (RA)를 이용하여 약 8 일 정도 소요된다. RA 를 사용하면 세포가 많이 죽어 분화된 세포를 얻는 양이 많이 떨어진다는 단점이 있어, 본 실험에서는 일반적으로 알려진 P19 세포 분화 방법과 달리 혈청이 없는 배양 조건에서 4 일간 분화를 유도 하였다. P19 세포에 Shh 이 과 발현 되는 세포 주인 P19/hShhN 를 만들었고 P19 세포의 세포 증식과 분화에서 Shh 의 효과를 알아보았다. Shh 이 과 발현되고 있는 P19 세포는 일반 P19 세포 보다 세포증식 속도가 빨랐고, 분화 조건에서도 역시 세포증식 속도가 빨랐다. 또한 P19/hShhN 세포는 일반 P19 세포보다 신경세포로의 분화 비율이 높았다. 일반적으로 세포증식과 분화는 상반적인 것으로 알려져 있는데 본 실험에서는 Shh 에 의해 세포증식과 분화 모두 증가가되어 신경줄기세포 혹은 신경전구 세포에서 특이적으로 발현하는 nestin 을 발현하는 P19/pNPEeGFP 세포를 이용하여 Shh 가 신경전구세포의 생존에 관여하고 있음을 확인하였다. 아마도 P19/hShhN 세포의 세포증식과 신경세포로의 분화 모두에서 Shh 은 P19 세포로부터 신경세포로의 운명을 결정해주고 신경세포로 분화할 수 있는 신경전구세포의 세포 증식을 유도하는 것으로 보인다. Shh 은 도파민성 신경세포와 운동신경세포의 분화를 유도하는데 중요한 역할을 한다고 알려져 있는데, 본 실험에서 나타나는 신경세포가 어떠한 신경세포로 분화되는지 각각의 신경세포 전사인자와 특이 단백질 의 발현을 알아 보았다. 그 결과 도파민성 신경세포와 운동신경세포 모두에 관여하는 전사인자와 특이 단백질의 발현이 Shh 에 의해 증가되었지만, 도파민성 신경세포보다는 운동신경세포로의 분화를 좀 더 유도하였다.운동성신경세포가 분화되는 과정에서 Shh 은 세포들이 분화 할 수 있는 환경을 조성해준다. 이후, 운동신경세포가 분화하는데 있어서 필요한 bHLH 전사 인자와 Homeobox 유전자가 발현되고 운동신경세포 특이 단백질이 발현한다. P19/hShhN 세포에서 운동신경세포에 관여하는 Nkx6.1, Olig2 그리고 Ngn2 의 발현이 증가하였고 운동신경세포 특이 단백질인 Hb9 과 ChAT 의 발현도 증가하였다. 따라서 본 실험에서 이용한 분화 방법을 통해서 Shh 이 운동신경세포로의 분화를 유도함을 알 수 있었다. 본 연구에서, Shh 은 운명이 결정되지 않은 줄기세포의 신경세포 유도, 신경세포로 분화할 수 있는 신경전구세포의 세포증식 그리고 CNS 의 dorsoventral 형성과 같은 다양한 기능을 갖고 있음을 확인하였다.