Sonic hedgehog induces Motor Neuron Differentiation in P19 Embryonic Carcinoma Cells

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dc.contributor.advisor서해영-
dc.contributor.author박래희-
dc.date.accessioned2019-10-21T06:46:47Z-
dc.date.available2019-10-21T06:46:47Z-
dc.date.issued2005-08-
dc.identifier.other614-
dc.identifier.urihttps://dspace.ajou.ac.kr/handle/2018.oak/16565-
dc.description학위논문(석사)--아주대학교 대학원 :의학과,2005. 8-
dc.description.abstractSonic hedgehog (Shh) 은 포유동물의 발생과정에서 Central neuvous system (CNS)의 초기 dorso-ventral 형성 과정을 유도하는 morphogen 으로서 알려졌다. 이것은 Notochord 와 floor plate 으로부터 분비되고 여러 Hh 들 중의 하나이다. 또한, Shh 은 Full length 로 발현되어 N-말단과 C-말단으로 나뉘게 된다. 여기서 ShhN-말단이 기능적인 부분으로 발생초기에 도파민성 신경세포와 운동신경세포의 분화를 유도하는 것으로 알려져 있다. 이것이 세포 밖으로 분비되어 수용체인 Patched 에 결합하면 Shh 과 관련된 세포 신호 전달이 시작된다. 최근, CNS 발달 과정 중에서 Shh 은 Oligodendrocyte 와 운동신경세포뿐만 아니라 신경전구세포의 증식과 신경돌기의 조절과 같은 다양한 세포의 특징을 결정하는 기능을 한다고 알려졌다. 본 연구에서 신경세포 분화에서 Shh 의 기능을 연구하기 위해 in vitro 에서 P19 세포를 이용하였다. P19 세포는 배아 줄기세포처럼 세배엽으로 모두 분화 할 수 있는 능력을 지녔으며 배양하기가 매우 용이 하다는 장점을 가졌다. 일반적으로 P19 세포의 분화 유도는 retinoic acid (RA)를 이용하여 약 8 일 정도 소요된다. RA 를 사용하면 세포가 많이 죽어 분화된 세포를 얻는 양이 많이 떨어진다는 단점이 있어, 본 실험에서는 일반적으로 알려진 P19 세포 분화 방법과 달리 혈청이 없는 배양 조건에서 4 일간 분화를 유도 하였다. P19 세포에 Shh 이 과 발현 되는 세포 주인 P19/hShhN 를 만들었고 P19 세포의 세포 증식과 분화에서 Shh 의 효과를 알아보았다. Shh 이 과 발현되고 있는 P19 세포는 일반 P19 세포 보다 세포증식 속도가 빨랐고, 분화 조건에서도 역시 세포증식 속도가 빨랐다. 또한 P19/hShhN 세포는 일반 P19 세포보다 신경세포로의 분화 비율이 높았다. 일반적으로 세포증식과 분화는 상반적인 것으로 알려져 있는데 본 실험에서는 Shh 에 의해 세포증식과 분화 모두 증가가되어 신경줄기세포 혹은 신경전구 세포에서 특이적으로 발현하는 nestin 을 발현하는 P19/pNPEeGFP 세포를 이용하여 Shh 가 신경전구세포의 생존에 관여하고 있음을 확인하였다. 아마도 P19/hShhN 세포의 세포증식과 신경세포로의 분화 모두에서 Shh 은 P19 세포로부터 신경세포로의 운명을 결정해주고 신경세포로 분화할 수 있는 신경전구세포의 세포 증식을 유도하는 것으로 보인다. Shh 은 도파민성 신경세포와 운동신경세포의 분화를 유도하는데 중요한 역할을 한다고 알려져 있는데, 본 실험에서 나타나는 신경세포가 어떠한 신경세포로 분화되는지 각각의 신경세포 전사인자와 특이 단백질 의 발현을 알아 보았다. 그 결과 도파민성 신경세포와 운동신경세포 모두에 관여하는 전사인자와 특이 단백질의 발현이 Shh 에 의해 증가되었지만, 도파민성 신경세포보다는 운동신경세포로의 분화를 좀 더 유도하였다.운동성신경세포가 분화되는 과정에서 Shh 은 세포들이 분화 할 수 있는 환경을 조성해준다. 이후, 운동신경세포가 분화하는데 있어서 필요한 bHLH 전사 인자와 Homeobox 유전자가 발현되고 운동신경세포 특이 단백질이 발현한다. P19/hShhN 세포에서 운동신경세포에 관여하는 Nkx6.1, Olig2 그리고 Ngn2 의 발현이 증가하였고 운동신경세포 특이 단백질인 Hb9 과 ChAT 의 발현도 증가하였다. 따라서 본 실험에서 이용한 분화 방법을 통해서 Shh 이 운동신경세포로의 분화를 유도함을 알 수 있었다. 본 연구에서, Shh 은 운명이 결정되지 않은 줄기세포의 신경세포 유도, 신경세포로 분화할 수 있는 신경전구세포의 세포증식 그리고 CNS 의 dorsoventral 형성과 같은 다양한 기능을 갖고 있음을 확인하였다.-
dc.description.tableofcontentsCONTENTS Ⅰ. INTRODUCTION = 1 A. shh (Sonic hedgehog) = 1 B. Transcriptional regulation of development by Shh = 4 1. Midbrain dopaminergic neuron = 4 2. Spinal cord motor neuron = 5 C. P19 embryonic carcinoma cells = 6 Ⅱ. MATERIALS AND METHODS = 8 A. MATERIRALS = 8 B. METHODS = 9 1. P19 cell culture = 9 2. Purification & titeration of 5E1 antibody = 9 2.1 Affinity chromatography = 9 2.2 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) = 10 3. Preparation of Shh conditioned medium = 10 4. Concentration of secreted ShhN = 11 5. Growth kinetics = 11 6. MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] assay = 12 7. Differentiation of P19 cell = 12 7.1 Conventional neuronal differentiation = 12 7.2 Current neuronal differentiation = 13 8. Reverse Transriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) = 14 9. Western blotting = 15 10. Immunocytochemistry = 16 Ⅲ. RESULTS = 17 1. Expression of hShhN in P19 cells = 17 2. Preparation of 5E1, a neutralizing antibody against Shh = 19 3. The concentration of secreted Shh = 19 4. Shh induces proliferation of P19 cells = 22 5. Shh induces neuronal differentiation of P19 cells = 25 6. Shh promotes neuronal precursor cell/ motor neurons survival or proliferation = 28 7. Shh induces motor neuron differentiation in P19 cells = 30 8. Shh induces dopaminergic and motor neuron differentiation in P19 cells = 34 9. Shh promotes neuronal differentiation in P19 cells without treatment of RA or aggregation culture = 37 Ⅳ. DISCUSSION = 39 Ⅴ. CONCLUSIONS = 43 REFERENCES = 44 국문요약 = 54-
dc.language.isoeng-
dc.publisherThe Graduate School, Ajou University-
dc.rights아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.-
dc.titleSonic hedgehog induces Motor Neuron Differentiation in P19 Embryonic Carcinoma Cells-
dc.title.alternativeShh에 의한 P19 세포를 운동신경세포로의 분화 유도-
dc.typeThesis-
dc.contributor.affiliation아주대학교 일반대학원-
dc.contributor.alternativeNamePark, Rae Hee-
dc.contributor.department일반대학원 의학과-
dc.date.awarded2005. 8-
dc.description.degreeMaster-
dc.identifier.localId564748-
dc.identifier.urlhttp://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000000614-
dc.subject.keywordSonic hedgehog-
dc.subject.keywordProliferation-
dc.subject.keywordDifferentiation-
dc.subject.keywordMotor neurons-
dc.subject.keywordP19-
dc.description.alternativeAbstractSonic hedgehog (Shh) is a member of the hedgehog family of signalling molecules and secreted from two signalling centers, the notochord and the floor plate, where it functions as a morphogen to induce early dorso-ventral patterning of the cenral nervous system (CNS). More recently, multiple actions of Shh during CNS development have been discovered in additional sites, where it specifies the fates of oligodendrocytes and motor neurons as well as proliferation of neural precursors and control of axon outgrowth. To explore the roles of Shh in neuronal differentiation, we utilized embryonal carcinomal P19 cells as an in vitro model system. We overexpressed Shh in P19 cells and investigated it’s effects on proliferation and differentiation of P19 cells., P19/Shh, P19 cells overexpressing Shh, proliferated at higher rates than normal P19 cells even when normal P19 cells stopped growth and underwent differentiation. Ironically, P19/Shh also differentiated into neurons at higher rates than normal P19 cells. Upregulation of both proliferation and neuronal differentiation P19/Shh suggests that Shh may induce neuronal fates from uncommitted P19 cells and concomitantly promote the proliferation of the resulting neuronal precursor cells. As expected motor neuron markers (Hb9, ChAT) as well as a dopaminergic neuron marker (TH) were upregulated in neuronal cells derived from P19/Shh. Collectively, these results suggest that Shh may have multiple functions in neural induction of uncommitted stem cells, proliferation of neural precursors, and dorso-ventral patterning of the CNS.-
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Graduate School of Ajou University > Department of Medicine > 3. Theses(Master)
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