Oligomycin에 의해 유도된 미토콘드리아의 형태변화에 대한 연구

Abstract

목적: 미토콘드리아는 세포가 필요로 하는 대부분의 에너지를 생산하며 또한 환경의 변화나 요구에 따라 자신의 모양, 이동 및 수가 다양하게 변하는 특성을 지닌 역동적인 세포내 소기관이다. 이러한 미토콘드리아에서 에너지 생산을 담당하는 복합체 (효소)인 Complex Ⅴ의 기능이 oligomycin에 저해되어 세포고사가 유도될 때 나타나는 미토콘드리아의 분포 및 형태 변화를 자세히 관찰하여 분석하고, 이 현상이 미토콘드리아의 기능변화 및 세포고사와 어떤 연관이 있으며, 또한 어떠한 기전에 의해 유도되는지를 밝힘으로서 Complex V의 기능이상으로 유발된 미토콘드리아의 역방향 신호전달 체계에 대해서 알아보고자 하였다. 방법 및 재료: Oligomycin에 의해 유도된 세포고사에서 특이적으로 관찰되는 미토콘드리아의 기능 변화. 세포주기 조절의 변화, 활성산소 증가, 미토콘드리아의 분열 정도 등을 알아보기 위하여 사람의 정상 간 세포주인 Chang 세포주와 형광 단백질을 미토콘드리아에 적중시켜 발현시킨 mtRFP Chang, mtYFP Chang 세포주를 실험에 사용하였다. Oligomycin을 비롯한 다섯 가지 호흡 사슬 억제제들을 처리한 후, 광학 현미경으로 세포의 형태 변화를 관찰하였고, PI 염색을 통하여 세포주기의 진행을 조사하였다. 세포고사를 확인하기 위해 poly- ADP-ribose polymerase의 분절과 phosphatidylserine의 노출을 검사하였다. 또한 형광현미경을 이용해서 미토콘드리아의 형태를 세포가 살아있는 상태에서 실시간으로 혹은 고정하여 관찰하였으며, 미토콘드리아를 분리하거나 세포 면역형광 염색법을 사용하여 cyt. c의 유출을 조사하였고, DCFH-DA의 염색을 통해 활성산소의 양을 측정하였고, luciferase-luciferin 반응을 통해 세포내 ATP의 변화를, 또한 respirator를 이용하여 세포의 산소 소비도를 조사 하였다. 결과: 정상 간세포주인 Chang 세포주에 미토콘드리아의 호흡 사슬 억제제들을 처리하였다 [Rotenone (10μM), TTFA (600μM), Antimycin A (50μM), KCN (5mM), Oligomycin (50μM)]. 처리 후 15시간 후에 세포의 형태변화를 관찰한 결과 억제제들은 모두 각기 다른 세포의 형태 변화를 유도하고 이중 oligomycin의 경우 모서리가 둥근 정다각형형태의 세포 모양을 많이 보였다. 또한 이때의 미토콘드리아의 분포와 형태를 보았을 때, oligomycin을 비롯해서 antimycin A, TTFA를 처리한 경우에서 미토콘드리아들이 과(過) 분절되어 있는 것을 보았으며 이중 oligomycin에서 미토콘드리아들이 세포질에 부분적으로 응축되어 있는 현상을 관찰할 수 있었다. 이러한 과(過) 분절의 시기를 관찰해본 결과, oligomycin의 경우 다른 억제제들과는 다르게 상당히 초기에 (처리 후 15분 이내) 빠르게 분절이 유도되며, 이러한 분절의 원인을 찾기 위해 ATP와 ROS의 연관성을 실험해 본 결과 ATP의 세포내 농도에는 영향을 받지 않으나 항산화제를 처리했을 경우에 분절이 지연되는 것을 관찰하였다. 또한 이런 과(過) 분절 과정에도 불구하고 초기의 cyt. c 는 미토콘드리아와 정확하게 같이 분포하고 있으며 대략 16시간이 경과한 지점부터 그 유출이 시작됨을 관찰함으로서 이러한 초기의 분절과 cyt. c 유출은 연관이 없음을 밝혔다. 결론: 이상의 결과에서 oligomycin을 Chang 세포주에 처리 하였을 때 유도된 세포 고사 과정에서 나타난 미토콘드리아의 분절(fragmentation)의 기전을 연구하여 다음과 같은 결론을 얻었다. Oligomycin를 처리해서 미토콘드리아 기능이상을 유도 했을 때 유도 초기에 빠르고 높은 활성산소의 증가가 유도되고, 이런 초기의 빠른 활성산소의 증가는 미토콘드리아를 빠르게 분절시키는 요인 중 하나가 된다. 이러한 활성산소의 특정 농도가 미토콘드리아의 분절 기작의 중요한 조절 요소라고 생각되어지며, 또한 이러한 기작에서 ATP는 그다지 큰 역할을 하지 않은 것으로 보인다. 미토콘드리아의 분절과 세포고사와의 관계를 관찰해본 결과, oligomycin에 의한 초기의 분절은 cyt. c 의 유출을 유도하지 못하였다. 이는 분절이 세포고사의 직접적인 유도기전이 아닐 수도 있음을 암시한다.