뇌출혈과 척수 손상 동물모델에서 Bcl-XL 과발현 인간신경줄기세포의 치료효과

Abstract

신경줄기세포를 이용한 치료는 여러 신경질환동물모델에 적용되어 왔으나 이식한 세포 대부분이 apoptosis에 의해 사멸하는 문제점을 가지고 있다. 본 학위 연구에서는 apoptosis를 저해하는 유전자인 Bcl-XL를 인간신경줄기세포에 과 발현 시켜 이식 후 세포의 생존 률을 높이고 이에 따른 이식세포의 분화양상과 행동학적 기능의 향상여부를 관찰하였다. In vitro 에서 인간신경줄기세포에 retrovirus를 이용하여 인간 Bcl-XL gene을 과 발현 시켜 세포주를 만들었다. 이러한 세포 주는 RT-PCR과 immunocytochemistry를 통해 neural stem cell 의 성격 및 분화 양상이 그대로 유지되고 있는 것을 확인하였다. Bcl-XL을 과발현시킨 신경세포가 세포사에 대한 저항력을 가지는 알아보기 위하여 STP를 처리하였고 약 12시간째부터 생존률이 현저하게 높은 것을 확인 하였다. Bcl-XL 과발현한 신경줄기세포가 in vivo 에서 생존률이 얼마나 차이가 나는지 보고자 정상 rat brain에 이식하여 이식 1주 후에는 29%가 3주후에는 56%가 차이가 나는 것을 확인하였으며 이들은 striatum, cortex, corpus callosum 에 분포하고 있는 것을 eGFP stain을 통하여 확인하였다. Collagenase Ⅶ을 사용하여 intracerebral hemorrhage model를 만들고 7일 후 신경줄기세포를 이식하여 1주와 3주 후에 injury 부분으로 세포들이 이동한 것을 확인하였다. 3주 후에는 생존 률이 약 40%정도 차이가 났으며 neurofilament(NF) 염색 통하여 이식한 세포가 신경세포로의 분화 가능성을 확인 하였고, rotarod test에 의해서 신경학적 기능이 많이 호전되었음을 알 수 있었다. Contusive spinal cord injury model에 Bcl-XL 과발현한 신경줄기세포를 이식 후 손상부위로 세포가 이동하는 것을 관찰하였으며, 생존률이 F3에 비해 열배 정도 높은 것을 human mitochondria 염색을 실시하여 확인하였다. BBB, Grid, Foot print analysis 를 실시하여 locomotor recovery가 향상 된 것을 확인하였으며, 이러한 호전은 이식 세포의 분화에 의한 것이라기 보다는 이식 세포가 cellular scaffolder 로써 axon의 재생에 영향을 주었기 때문이라고 생각하게 되었다. 그 이유는 immunohistochemistry를 통해 확인한 결과 분화한 세포들이 많지 않았음에도 불구하고 locomotor recovery 가 향상 되었기 때문이다. 이것을 뒷받침해주는 결과로 손상부위로 이동한 세포들이 모여있는 곳으로 host의 axon이 지나가는 것을 NF 염색으로 확인하였고 5-HT 염색을 통해서 host axon과 이식한 세포 사이의 association 이 이루어져 host axon의 traversing을 유도하는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 retrograde tracer 인 fluorogold를 사용하여 lumbar spinal cord와 red nucleus 사이의 axonal connection를 보았는데 역시 Bcl-XL 과발현한 신경줄기세포주를 이식한 그룹에서 FG labled rubrospinal neurons이 4배정도 많은 것을 확인 하였다. Bcl-XL를 과발현한 신경줄기세포주는 이식 후 apoptosis에 의한 세포사에 저항력을 가져 생존 률이 높았으며 생존세포가 늘어난 것에 의한 행동학적 기능도 향상된 것을 intracerebral hemorrhage model과 spinal cord injury model에서 관찰 할 수 있었다. 본 연구에서는 이식세포의 분화률이 높지 않았음에도 불구하고 행동 학적 기능이 향상된 것을 확인 할 수 있었는데, minocycline(염증반응 억제), neurotropic fatctor인 GDNF 등과 같은 coeffector 를 처리하여 이식한 세포의 분화률을 높인다면 좀더 나은 결과를 기대할 수 있을 것으로 생각된다.