Inhibition of Cell Division Cycle by Overexpression of TIS21/BTG2/PC3

Abstract

세포생장억제유전자인 TIS21 (TPA inducible sequences 21)은 early growth response genes의 한 종류이며 TPA을 처리한 SW3T3 세포에서 동정되었다. TPA에 의해 유도된 TIS21 mRNA의 발현은 즉각적이며 일시적이다. TIS21의 동종유전자에는 rat PC12 세포에서의 PC3 유전자와 인간에서의 BTG2 (B-cell translocation gene 2) 유전자가 존재한다. TIS21의 세포 생장 억제 기전을 연구하기 위해 우선 TIS21 유전자를 293 세포(p53와 Rb 단백질 기능이 불활성화된 세포)에 과발현시켰다. TIS21이 과발현되는 클론인 C9과 C11은 벡터가 도입된 V7과 V10 그리고 antisense가 도입된 AS1과 AS4보다 낮은 포화밀도를 보였으며 세포의 크기가 주요하게 커졌다. 혈청으로 유도시킨 세포주기를 관찰하기 위해 double thymidine 처리방법을 이용하여 FACS 분석을 실행하였다. V10은 정상적인 세포분열주기를 보이는 반면에 C9과 C11은 36시간까지 G1 주기에 세포가 머물려 있었다. 그러나 C9과 C11은 S 주기나 G2/M 주기로의 도입에는 영향이 없었다. 세포주기 조절 단백질들을 조사해 보았을 때, C9과 C11 세포는 Cyclin E 와 Cdk4 단백질의 합성이 현저히 억제되었으며 또한 Cyclin E-associated Cdk 활성도 억제되어 있었다. 이러한 실험결과로 293 세포(pRb와 p53이 불활성된 세포)에서 TIS21의 과발현은 Cyclin E와 Cdk4의 양적 감소로 G1-S 전이에 관련된 Cdk들의 활성이 감소된다는 결론을 내렸다. 그리고 한편 p53 기능이 결여된 U937 세포에서 TIS21을 과발현시켰을 때 다른 생장억제기전을 알게 되었다. TPA에 의해 유도된 TIS21의 발현은 PKC-δ 의 활성에 의하면 이는 cPKC isozymes에 의해 강하게 억제된다. U937 세포에 TPA와 Go6976가 처리되었을 때 TIS21 mRNA의 발현이 TPA 단독처리보다 오래 유지되었다. 이 현상은 TPA와 Go6850가 처리되었을 때는 보이지 않았다. FACS로 분석하였을 때, TPA에 의해 유도된 G2/M arrest는 Go6850에 의해 현저하게 억제되는데 이는 TIS21와 nPKC isozymes과의 관련성을 보여준다. 더불어 PKC-δ은 G2/M arrest와 TIS21 발현의 조절자로 알아냈으며, 그 TIS21 발현의 조절은 rottlerin과 dominant negative PKC-δ 실험으로 확인하였다. In vivo에서 TIS21 단백질의 축적은 caspase 3에 의한 세포 죽음을 유도하였으며, 이는 TIS21ΔC 발현세포에서 procaspase 3, full length PKC-δ, pRb 그리고 p21Waf1 분해로 확인되었다. 그리고 세포에 nocodazole를 처리 후 해제시켰을 때, 벡터 발현세포에서는 해제 3시간 후에 Cyclin A와 Cyclin B1의 분해가 급격하게 일어난 반면에 TIS21 과발현세포는 해제 3시간 후에도 Cyclin A와 Cyclin B1의 분해가 억제되었다. 더욱이 TIS21는 Cyclin B1-Cdc2 결합과 인산화효소 활성을 in vivo에서 억제시킨다는 결과를 얻게 되었다. 이 p53 기능이 결여된 U937 세포에서의 실험결과는 TPA에 의한 TIS21 mRNA 발현은 PKC-δ을 통해 유도되고, TIS21 단백질은 Cdc2와의 결합을 통해 Cyclin B1-Cdc2 결합과 그 인산화효소 활성을 억제함으로서 G2/M arrest 와 세포 죽음을 유도한다는 것을 말한다. 즉 결론은 TIS21의 발현은 p53과 pRb의 기능이 결여된 상태에서는 pRb independent pathway을 통해 Cyclin E와 Cdk4을 불활성 시켜 G1-S arrest을 유도하며, p53만 기능이 결여되고 pRb은 정상적인 경우에는 G1-S arrest가 아니라 Cyclin B1-Cdc2 기능을 억제하여 G2-M arrest을 유도하여 세포들의 생장을 억제한다는 것이다. 이는 p53 또는 pRb 기능이 결여된 많은 암세포에서 생장을 억제할 수 있는 기작으로 TIS21이 주요한 위치를 차지한다는 것을 암시한다.